一种利用磷霉素选育达托霉素高产菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用筛选对磷霉素敏感的玫瑰孢链霉菌从而获得达托霉素高产菌株的方法，属于菌种的选育技术。该方法包括以下过程：斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，经UV处理后，涂布于分离培养基上，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有不同浓度的磷霉素的固体筛选培养基上，选取对不同浓度磷霉素敏感的菌落，接种于斜面培养基上培养，最终进行液体培养，从中选出具有稳定遗传性状的高产菌株。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种利用筛选对磷霉素敏感的玫瑰孢链霉菌从而获得达托霉素高产菌株的方法，属于菌种的选育技术。该方法包括以下过程：斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，经UV处理后，涂布于分离培养基上，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有不同浓度的磷霉素的固体筛选培养基上，选取对不同浓度磷霉素敏感的菌落，接种于斜面培养基上培养，最终进行液体培养，从中选出具有稳定遗传性状的高产菌株。【专利说明】
本专利技术属于微生物菌种筛选的
，特别涉及利用磷霉素筛选达托霉素高产菌株的技术。
技术介绍
随着抗生素药物在临床上的广泛应用，细菌的耐药性问题越来越严重，引起人们的广泛关注。万古霉素长期以来一直作为防御许多严重革兰氏阳性菌感染的最后防线，但随着频繁的临床应用，其耐药菌株也越来越多，万古霉素目前临床应用已非十分理想。因此研发新型的抗耐药菌抗生素就具有非常重要的意义。 达托霉素是由礼来([117)公司最初研究，(^1)3181:制药公司开发的一种环脂肽类抗生素。2003年9月，作为一种全新结构类别的抗生素在美国首次上市。这种抗生素是从玫瑰孢链霉菌(31^61)1:01117068发酵液中提取得到的一个环脂肽类物质，它不仅具有新颖的化学结构，而且其作用模式也与任何一个已获批准的抗生素都不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的。 由于其独特的抗菌特性及良好的市场前景，近几年来，国内不少单位陆续开始研究。2006年，天津大学公开了一种激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法:2007年由中国科学院上海有机化学研究所公开了一种达托霉素的合成方法。国内也有人在做菌种的筛选和遗传育种工作，但是都是刚刚开始，还没能够达到工业化生产的要求，所以，如何提高!'086081)01*118链霉菌中的达托霉素的产量将对其产业化生产，以及产品的销售和市场占有份额都具有重要的意义。 磷霉素是通过阻碍细胞壁合成中仙？41。嫩丙酮酸转移酶的反应，从而抑制细胞壁的合成。可以设想，如果以磷霉素$01)为“筛子”，凡是对？01敏感度高的菌株，则其细胞壁合成中的这一点就可能有缺陷，使之不能很好地合成细胞壁，而转向合成抗生素，达到选育闻广菌株的目的。范铭綺等利用憐霉素筛选氣基糖昔类抗生素6101&闻广菌株中获得了成功，与亲株相比效价提高了 75?101%。而把磷霉素应用与达托霉素产生菌的选育方面，则未见相关的专利和文献的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种利用筛选对磷霉素敏感的玫瑰孢链霉菌从而获得达托霉素高产菌株的方法，依此方法可有效的提高达托霉素的产量。 本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的:，其特征在于包括以下过程:玫瑰孢链霉菌(31^61)1:01117068亲株的斜面孢子用无菌水制成105-107个孢子加1的单孢子悬液，将1-3“的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理0.5-1.5分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10—3-10—5后，涂布于培养平板中26-281培养7-8天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有200-10009 8加1的磷霉素的筛选平板上，挑取对相应浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6-7天后，接种于装有3001液体发酵培养基的25001摇瓶，于28-301，转速为200-22011)111的摇床中培养120-16011，通过!1？！^，检测达托霉素产量，从而获得高产的达托霉素产生菌。 上述的筛选平板中磷霉素的含量为:200^ 8加1或400^1 8加1或600 ^ 或 800 9或 1000 9 邑/爪工。 上述的液体发酵培养基组成及质量含量为:可溶性淀粉6-10&酵母粉4-68，糊精10-208，干酪素3-58，胰蛋白胨4-108，^28043~58？卜天冬酰胺1-38，溶于11自来水中，？抓5。 本专利技术采用的通过筛选磷霉素敏感菌株来获得达托霉素高产菌株，设备简单、方法宜行、效果良好，选育出的菌株正突变率为1-25 %，发酵单位比出发菌株提高0.3-2.9倍。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明，但应理解本专利技术的范围非仅限于这些实施例的范围。 实施例1亲株的斜面孢子用无菌水制成105-107个孢子加1的单孢子悬液，将21111的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理0.5分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10—3-10—5后，涂布于培养平板中261培养7天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有1000^ 8加1的磷霉素的筛选平板上(组成为，酵母粉如，麦芽浸出粉此，葡萄糖38，磷霉素18，琼脂208，去离子水1匕1?自然)，挑取对该浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6天后，接种于装有30“液体发酵培养基的250“摇瓶(组成为可溶性淀粉8@，酵母粉如，糊精108，干酪素5@，胰蛋白胨如，1^230438，[-天冬酰胺18，溶于自来水中，5)，于281，转速为200印111的摇床中培养120卜，通过!1？！^，检测达托霉素产量，正突变率为1-2%。发酵单位比亲株提高0.3-0.4倍。 实施例2 亲株的斜面孢子用无菌水制成105-107个孢子加1的单孢子悬液，将21111的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理0.6分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10—3-10—5后，涂布于培养平板中261培养7天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有800 ^ 8加1的磷霉素的筛选平板上(组成为，酵母粉如，麦芽浸出粉此，葡萄糖如，磷霉素0.88，琼脂208，去离子水1匕？11自然)，挑取对该浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6天后，接种于装有3001液体发酵培养基的25001摇瓶(组成为可溶性淀粉彻，酵母粉5@，糊精10&干酪素如，胰蛋白胨6@，130438，1-天冬酰胺18，溶于自来水中，户取.5)，于281，转速为200印111的摇床中培养120卜，通过即!^，检测达托霉素产量，正突变率为4-5%。发酵单位比亲株提高0.8-1.0倍。 实施例3 亲株的斜面孢子用无菌水制成105-107个孢子加1的单孢子悬液，将21111的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理1.0分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10—3-10—5后，涂布于培养平板中261培养7天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有600^ 8加1的磷霉素的筛选平板上(组成为，酵母粉如，麦芽浸出粉此，葡萄糖38，磷霉素0.68，琼脂208，去离子水1匕1?自然)，挑取对该浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6天后，接种于装有3001液体发酵培养基的25001摇瓶(组成为可溶性淀粉彻，酵母粉5@，糊精10&干酪素如，胰蛋白胨6@，130438，1-天冬酰胺18，溶于自来水中，户取.5)，于281，转速为200印111的摇床中培养120卜，通过即!^，检测达托霉素产量，正突变率为12-13%。发酵单位比亲株提高1.4-1.6倍。 实施例4 亲株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用磷霉素选育达托霉素高产菌株的方法，其特征在于包括以下过程：将玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)亲株的斜面孢子用无菌水制成105‑107个孢子/ml的单孢子悬液，将1‑3ml的孢子悬液分装于玻璃皿中，于15瓦紫外灯下处理0.5‑1.5分钟，然后将辐射处理的孢子悬液用无菌水稀释到10‑3‑10‑5后，涂布于培养平板中26‑28℃培养7‑8天，用无菌竹签将长出的菌落挑出接种于含有200‑1000μg/ml的磷霉素的筛选平板上，挑取对相应浓度磷霉素敏感的菌落，于斜面培养基培养6‑7天后，接种于装有30ml液体发酵培养基的250ml摇瓶，于28‑30℃，转速为200‑220rpm的摇床中培养120‑160h，通过HPLC，检测达托霉素产量，从而获得高产的达托霉素产生菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈依群，张晓来，陆茂林，钱国芬，许春燕，司竑飞，杨晓伟，
申请(专利权)人：江苏省微生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32