一种果聚糖酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种果聚糖酶及其编码基因与应用。该果聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：１）序列表中的ＳＥＱ？ＩＤ？№．２的氨基酸残基序列；２）将序列表中的ＳＥＱ？ＩＤ？№．２氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有果聚糖酶活性和／或植物抗旱相关功能的蛋白质。本发明专利技术的果聚糖酶及其编码基因可提高植物中果聚糖的浓度，提高植物抗逆性水平。本发明专利技术的果聚糖酶编码基因将在单子叶植物中（水稻、小麦、玉米、牧草、冰草）等植物抗逆育种中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一种果聚糖酶及其编码基因与应用，特别涉及来源于冰草的一个果聚糖 果聚糖-1-果糖基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
植物细胞中的果聚糖是一种天然的渗透调节物，是贮藏碳水化合物的主要物质， 主要储存于植物细胞的液泡中。植物果聚糖的合成至少涉及了 3个重要的酶蔗糖-蔗糖 果糖基转移酶(SST)、果聚糖_果聚糖果糖基转移酶(FFT)、蔗糖_果聚糖果糖基转移酶(SFT)(本专利技术的果聚糖酶属于果聚糖-果聚糖果糖基转移酶(FFT)。目前已经克隆出一 系列参与植物果聚糖合成的相关酶类，包括大麦的SFT、洋葱的FFT、高羊茅的SST等。当把 这些基因导入果聚糖缺乏的植物时，将导致多聚果聚糖的积累，而在积累果聚糖的植物中 产生新的果聚糖。研究表明，转基因植株不仅体内果聚糖的含量大大提高，而且显著地提高 植物的抗逆性和改良营养品质。 冰草(Agropyron cristatum(L. )Gaertn)是优良多年生牧草之一，具有很强的抗 旱性和抗寒性，适于在干燥寒冷地区生长，有着较高的营养价值，为马和羊等草原动物最喜 食。果聚糖是许多牧草植物产生并储存的可溶性碳水化合物主要形式。可溶性碳水化合物 水平的升高将抑制由于木质化引起的可消化性的降低，而且牧草中非结构性碳水化合物浓 度的增加，将导致反刍动物对牧草的吸收，在瘤胃中对蛋白质的获取和活体重增加。此外果 聚糖还有许多重要生理功能如调节植物适应低温光合作用、调控植物蔗糖分配等。因此从 牧草尤其是冰草中克隆果聚糖合成酶相关基因有着重大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的内容是提供了果聚糖酶及其编码基因 本专利技术所提供的果聚糖酶即为果聚糖果聚糖-l-果糖基转移酶(fructan:fructan-l-fructosyltransferase)，来源于冰草，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中SEQ ID N2 :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 (b)将SEQ ID N2 :2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果聚糖酶活性的由SEQ ID N2 :2衍生的蛋白质。 序列表中的SEQ ID N2 :2由649个氨基酸残基组成，自SEQ ID N2 :2的氨基端第 123位至127位为13 -果糖苷酶单元(蔗糖结合框)，自氨基端第247至249为RDP域，自 氨基端第306至307为EC域三个活性中心域，该蛋白具有果聚糖果聚糖-1-果糖基转移 酶活性。 所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 为了使SEQ ID N2 :2所示的蛋白便于纯化，可在由序列表中SEQ ID N2 :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 上述SEQ ID N2 :2所示的氨基酸序列可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达获得。编码基因可通过将序列表中SEQ ID N2 :1自5'端第1至1950位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。 表1.标签的序列标签<table>table see original document page 4</column></row><table> 上述果聚糖酶的编码基因，名称为AG-FFT-1，其cDNA具有下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQ ID N2 :1的核苷酸序列； 2)编码序列表中SEQ ID N2 :2蛋白质序列的多核苷酸； 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 4)与序列表中1)、2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 序列表中SEQ ID N2 :1由1950个核苷酸组成，自5'端第1-1950位核苷酸为其编码序列，含有全长的cDNA序列(包含起始密码子ATG和终止密码子TAG)。 所述高严谨条件为在O. IXSSPE(或O. IXSSC)，O. 1% SDS溶液中，在65。C下杂交、洗膜。所述的数个氨基酸残基指不超过io个氨基酸的残基。 本专利技术的另一个内容是AG-FFT-1基因的应用，将AG-FFT-1的全长cDNA基因导入植物细胞中，获得耐逆植物。按如下步骤实施 1)采用PCR扩增的方法，以冰草的cDNA为模板，利用高保真KOD酶(Toyobo公司)扩增包含编码区序列的AG-FFT-1基因的全长cDNA，连入经过改造的表达载体pCambia3301m中(用Smal和EcoRI酶切下PDM805载体的Ubiquitin片段，连入以相同酶切的pCambia3301载体中，构建成pCambia3301m)。获得具有目的基因的表达载体AG-FFT+pCambia3301m。 2)将表达载体AG-FFT-l-pCambia3301m，通过电击转化法导入农杆菌菌株AGLl中，用于转化植物愈伤组织。 3)通过农杆菌介导的转化方法，将带有AG-FFT-l-pCambia3301m载体的农杆菌导入诱导的植物材料中，经过一系列的组培过程，获得再生的转基因植株。4 包含上述AG-FFT-1基因的重组表达载体，转基因细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。 本专利技术获得的AG-FFT-1全长cDNA所编码的氨基酸序列在NCBI生物数据库进行同源性搜索，在冰草属中还没有发现注册类似的序列，与普通小麦中l-FFT-A基因的氨基酸序列同源性达92%，与大麦中SST基因的氨基酸序列同源性达81%，与黒麦草的SST基因的氨基酸序列同源性达69%。因此，我们克隆获得的AG-FFT-1基因编码一新的未曾报道过的冰草果聚糖果聚糖-1-果糖基转移酶。 可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的相关基因导入植物细胞中。本专利技术的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(Hyg，NPTII，Bar等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本专利技术的AG-FFT-1基因的表达载体可通过直接DNA转化、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物组织中，并将转化的植物组织培育成植株。 本专利技术的果聚糖酶及其编码基因(AG-FFT-1)可提高植物中果聚糖的浓度，提高植物抗逆性水平。本专利技术的A果聚糖酶编码基因将在单子叶植物中(水稻、小麦、玉米、牧草、冰草)等植物抗逆育种中具有良好的应用前景。附图说明 图1为表达载体AG-FFT-l-pCambia3301m的T-DNA区结构简 图2为转AG-FFT-1基因黑麦草的PCR检测； 图3为转基因黑麦草的PPT抗性试验。 图4为转AG-FFT-l-pCambia3301m植株基因表达的鉴定结果。 图5为转AG-FFT-l本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种果聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：　　１）序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　№．２的氨基酸残基序列；　　２）将序列表中的ＳＥＱ　ＩＤ　№．２氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有果聚糖酶活性和／或植物抗旱相关功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
一种果聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果聚糖酶活性和/或植物抗旱相关功能的蛋白质。2. 权利要求l所述的果聚糖酶的编码基因。3. 根据权利要求2所述的果聚糖转移酶的编码基因，其特征在于所述果聚糖酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID N2 :1的核苷酸序列；2) 编码序列表中SEQ ID N2 :2蛋白质序列的多核苷酸；3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金霞，张治国，孙学辉，张小芸，路铁刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]