沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用。采用促进载体跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇双重修饰的方法，通过环氧氯丙烷将沙丁胺醇耦联到壳聚糖分子上，然后利用三氧化硫脲对壳聚糖氨基进行胍基化。对原始壳聚糖载体进行改性，提高其转染效率和对于呼吸道细胞的靶向性。合成方法简便，条件温和。这种改性后的壳聚糖用作基因载体，转染效率较未改性之前有显著提高。对于呼吸道疾病尤其是哮喘的基因治疗具有潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用，可以作为高效靶向非病毒基因载体在基因治疗中的应用。
技术介绍
载体系统的选择直接影响基因治疗的效率和安全性。常用的基因递送方法主要分 为两类，即病毒载体和非病毒载体导入技术。病毒载体转染效率高，是目前体内基因治疗的 主要工具。尽管病毒载体具有很高的转染效率，但其存在基因携带能力低、免疫原性和潜在 致瘤性等安全性隐患。非病毒载体为基因递送提供了另一条途径，目前非病毒载体主要有 脂质体、阳离子高聚物等。但是，因缺少病毒载体天然的基因递送机制，非病毒基因载体的 效率低下，极大地限制了其实际应用。 壳聚糖是一种被报道最多的聚合物转基因载体，也是唯一的一种天然阳离子多 糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，高阳离子电位。然而，同其他非病毒 载体一样，壳聚糖的转染效率低，细胞靶向性差，需要对其进行修饰，以提高其转染效率和 特异性。而壳聚糖分子上的羟基和氨基官能团为其联接靶向配体提高转染效率提供了可行 性。1.壳聚糖基因载体的特异性修饰 细胞膜表面存在着大量的受体蛋白，一些特异性基团会和某些细胞膜上的受体发 生相互作用而内化吸收。因而将这些特殊基团接到壳聚糖上，有助于增强壳聚糖与细胞膜 的作用，提高载体的跨膜转运效率，进而提高转染效率。同时由于这些基团特异性地针对某 些细胞上高表达的受体，实现高效率的同时有望实现靶向治疗。这种改性方法已经被广泛 的研究。半乳糖改性后的壳聚糖能够特异性地提高H印G2细胞的转染效率；转铁蛋白修饰 的壳聚糖在转染HEK293 cells和HeLa细胞时，效率比未修饰时要高出4倍；叶酸修饰的壳 聚糖对癌细胞的转染效率明显要高于未改性的壳聚糖；甘露糖修饰的壳聚糖，用于转染抗 原呈递细胞(APCs)Raw264. 7巨噬细胞，效率也得到了显著提高。 呼吸道上皮细胞，平滑肌细胞，肥大细胞，II型肺泡细胞的细胞膜表面富含13 2肾 上腺能受体。P 2受体激动剂如沙丁胺醇、沙美特罗、福美特罗等，能够和气道平滑肌和肥大 细胞膜表面的P 2受体相结合，并起到舒张气道平滑肌、减少肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱 颗粒及其介质的释放、降低微血管的通透性、增加气道上皮纤毛的摆动等效果。这几种 肾上腺能受体配体被广泛的用作哮喘治疗药物。因此通过将13 2肾上腺能受体激动剂(沙 丁胺醇)作为靶向配体，用化学方法耦联到壳聚糖上，一方面，可以利用其特异的和呼吸道 细胞表面受体结合能力，促进细胞膜对其吸收，实现对呼吸道细胞的高效靶向转染。另一方 面，利用这些药物的药理作用，同时起到药物协同治疗的作用。这种改性后的壳聚糖基因载 体，对哮喘病及其他呼吸道疾病的治疗具有重大的应用价值。 2.壳聚糖基因载体的胍基化修饰 细胞对载体/DNA复合物的内吞吸收是制约壳聚糖载体转染效率的一个重要原因，因此针对非病毒基因载体跨膜的研究也十分广泛。1988年，Green等证实人免疫缺损 病毒(HIV)-1的反式激活蛋白TAT能跨膜转移到细胞质和细胞核内。接着，其他一系列多 肽如单纯疱疹病毒(HSV)-1的VP22转录因子，核定位信号(NLS)也陆续被证实具有跨膜能 力。人们把此类能携带大分子物质进入细胞，具有穿膜能力的短肽称为细胞穿膜肽(cell penetrating p印tide)。细胞穿膜肽能作为生物大分子的有效载体，可提高各种生物大分 子，包括寡核苷、肽段、蛋白质、纳米颗粒和脂质体等进入细胞质或细胞核内的能力。Wender 等发现，精氨酸在细胞穿膜肽的跨膜中起到关键的作用。于是，可以推测相对于电荷或主 链结构来说，精氨酸中的特征基团胍基对于促进细胞内吞影响更显著。胍基可以与RNA主 链上的磷酸盐形成氢键，也可以和磷脂双分子层中的磷酸脂形成氢键。胍基的这种氢键作 用和本身的强碱性(pKa为 12. 5)可能成为控制这些富含精氨酸多肽跨膜的关键因素。 Wender课题组合成了一系列聚胍基类肽衍生物，实验发现部分衍生物体现出和精氨酸十聚 物相当的细胞摄取效率。同时，他们还提出了将多肽中的氨基进行胍基化的改性方法减少 多肽合成的费用。因此对非病毒基因载体进行具有跨膜能力的胍基修饰，有望提高细胞对 载体的内吞吸收，从而提高载体的转染效率。我们采取这种方法，对原有壳聚糖进行胍基修 饰。结果表明，和未修饰的壳聚糖相比，转染效率得到显著提高。经过胍基修饰的壳聚糖， 水溶性极大改善，解决了壳聚糖载体在中性条件下溶解困难的问题。此外，有研究表明胍基 化还有助于提高壳聚糖的天然抗菌效果。 与本专利技术有关的参考文献如下 Calnan B.J. ， Tidor B. ， Biancalana S. ， et al. Arginine-mediated RNA recognition :thearginine fork.Science. 1991 ;252 ;1167-1171. Ying Hu， Yumin Du， Jianhong Yang， et al. Synthesis, characterization and antibacterialactivity of gimnidinylated chitosan. Carbohydrate Polymers. 2007 5 67 ;66-72.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用。采用促进载体跨膜的胍基和具有靶向性的沙丁胺醇双重修饰的方法，通过环氧氯丙烷将沙丁胺醇耦联到壳聚糖分子上，然后利用三氧化硫脲对壳聚糖氨基进行胍基化。对原始壳聚糖载体进行改性，提高其转染效率和对于呼吸道细胞的靶向性。合成方法简便，条件温和。这种改性后的壳聚糖用作基因载体，转染效率较未改性之前有显著提高。本专利技术提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖的结构式表示为其中，壳聚糖Mw = 50kDa ;沙丁胺醇(Sal)接枝率5%;胍基(Gua)取代度17. 5%; 本专利技术提供一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖的制备方法包括以下步骤 1) 二氧化硫脲与双氧水的浓硫酸溶液在50-6(TC下反应100min，4t:冷却，静置 2h，加入过量无水乙醇沉淀出白色晶体，乙醇重结晶三次。最后再用无水乙醇洗涤，室温下用？205干燥，产物三氧化硫脲于41:密封保存。30%双氧水浓硫酸的体积比=i : 2。 2)壳聚糖在盐酸溶液中50-8(TC搅拌4h溶解，加入过量的NaOH溶液，絮状沉淀产物离心，10000r/min离心10min，倒掉上清液，得到胶状碱处理过的壳聚糖。 3)将沙丁胺醇溶于匿SO，加入环氧氯丙烷搅拌至均匀。迅速加入一定量NaOH(lM);室温反应4. 5h，然后加入胶状碱处理过的壳聚糖；继续反应4. 5h，反应液在透析去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，冻干。其中，沙丁胺醇、环氧氯丙烷壳聚糖单元摩尔数相等。 4)将冻干后的壳聚糖溶于水中，加入4倍于壳聚糖单元摩尔数的三氧化硫脲， 5(TC反应半小时，得透明澄清溶液，反应液在去离子水中透析5天(透析袋截留分子量 3500)，冻干。 本专利技术沙丁胺醇胍基双重修饰壳聚糖可以作为高效靶向非病毒基因载体在基因 治疗中的应用。用于转基因载体，实现提高壳聚糖载体基因转染效率的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖，其特征在于它的结构式为：　　＊＊＊　　其中，壳聚糖Ｍｗ≈５０ｋＤａ；沙丁胺醇（Ｓａｌ）接枝率５％；胍基（Ｇｕａ）取代度１７％。

【技术特征摘要】
一种沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖，其特征在于它的结构式为其中，壳聚糖Mw≈50kDa；沙丁胺醇(Sal)接枝率5％；胍基(Gua)取代度17％。F2009102451936C00011.tif2. —种权利要求1所述的沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖糖的制备方法，其特征在于它包 括以下步骤1) 二氧化硫脲与双氧水的浓硫酸溶液在50-6(TC下反应100min，4t:冷却，静置2h，加 入过量无水乙醇沉淀出白色晶体，乙醇重结晶三次；最后再用无水乙醇洗涤，室温用P205干燥，产物三氧化硫脲于4t:密封保存；双氧水浓硫酸的体积比=i : 2;2) 壳聚糖在盐酸溶液中50-8(TC搅拌4h溶解，加入过量的NaOH溶液，絮状沉淀产物离 心，10000r/min离心10min，倒掉上清液，得到胶状碱处理过的壳聚糖；3) 将沙丁胺醇溶于DMSO，加入环氧氯丙烷搅拌至均匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文广，孙鹏，徐军，罗永峰，
申请(专利权)人：天津大学，广州医学院，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]