本发明专利技术涉及一种５－羟色胺６受体配体的高效率检索方法，尤其是一种利用可稳定表达ＨＡ－５－ＨＴ６Ｒ的细胞系的５－羟色胺６受体配体高效率检索方法。本发明专利技术的细胞系可稳定地表达ＨＡ－５－ＨＴ６Ｒ，因此有效地提高了针对选择性地作用于５－ＨＴ６Ｒ的配体的检索效率，可以对结合５－ＨＴ６Ｒ的蛋白质的研究做出贡献。本发明专利技术可以有效地预防及诊断出５－ＨＴ６Ｒ相关抑郁症、阿尔茨海默之类的脑疾病及精神疾病，进而开发出其治疗剂。
【技术实现步骤摘要】
可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达 HA-5-HT6R的细胞系
本专利技术涉及一种5-羟色胺6受体(5-HT6R)配体高效率检索方法。
技术介绍
5-羟色胺受体(5-HTR)包括5-ffl\R到5_HT7R的各种亚型，目前为止被发现的种 类共有15种，被认为与抑郁症、精神分裂症、焦虑症(anxiety)及睡眠障碍等精神疾病及阿 尔茨海默病等有关。 其中，5-HTeR是最近探索出盐基序列的5-HTR，虽然还没有研究出其机制，但被 认为涉及到退化性脑疾病与精神疾病之类的疾病。根据最近的研究报告显示，5-HTeR的 剌激在生物化学及行动学方面可以呈现出类似于抗抑郁剂的效果，而且各种报告均指 出脑发育(brain development)、记忆禾口学习(learning and memory)及老年痴呆症 (Alzheimer disease)等很多重大脑部疾病都与其有密切关系(Grimaldi B et al.， Na皿ynSchmiedebergs Arch Pharmacol. 357 (4) :393-400,1999 ;Garcia-AllozaM et al.， Neuropsychopharmacology 29 (2) :410-416，2004 ;Lorke D etal. ， BMC Neurosci. 27 ; 7-36,2006 ;Greengard et al. ， J Neurosci. 27(15) :4201-4209，2007)。 以5-HTR作为 作用点的药物包括非选择性地结合于一切5-HTR的氯氮平(clozapine)，选择性地结合于 5-HTeR的药物为SB258585，但还无法作为疾病的治疗剂使用。在研究抑郁症或阿尔茨海默 病等疾病时，由于人们对于5-HTeR在脑细胞的具体功能及5-HTeR参与的信号传达机制几乎 没有任何认识，为了研究其功能与机制并选择性地开发配体，需要具备可以选择性地研究 5_HT6R的系统。 本专利技术人们制作出可以表达出HA (Hemagglutinin)被连接到N端(N-terminal) 的5-HT6R的细胞系，上述HA-5-HT6R暴露于细胞表面外部，可以稳定表达上述HA-5-HT6R并 维持上述5-HT6R的活性，确认了上述细胞系可以在5-HT6R的选择性配体的开发过程中进行 高效率检索。
技术实现思路
专利技术需要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种可以稳定表达5_HT6R的细胞系。 本专利技术的另一个目的是提供一种基于上述细胞系的5_HT6R配体高效率检索方法。 本专利技术的再一个目的是提供一种包含上述细胞系的5-HT6R配体高效率检索用组 成物。解决问题的技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供一种含有N端连接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R基因构建体的载体(vector)被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。本专利技术提供的5-HTeR配体高效率检索方法包括下列步骤步骤l，利用受检化合物处理本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，检查上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及 步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。本专利技术提供的5-HTeR配体高效率检索方法包括下列步骤步骤l，利用受检化合物处理本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 步骤2，精制上述经过处理的细胞系的蛋白质； 步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及 步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。 本专利技术还提供包含本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-HT6R配体高效率检 索用组成物。 下面说明本专利技术所使用的术语。 术语5_HT6R配体表示结合在5_HT6R而调节活性的物质。 下面详细说明本专利技术。 本专利技术提供一种通过含N端连接HA (Hemagglutinin)的5_HT6R基因构建体的载 体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 在本专利技术的较佳实施例中，把含有HA基因与取自人类绒毛膜癌细胞系的5_HT6R 基因连接而成的HA-5-HT6R构建体的载体(参照图1)转导到人胚肾细胞系(human embryonic kidney cell line ;HEK293细胞系)。利用PCR方法对特异表达HA-5-HT6R基 因的细胞系进行筛选后(参照图2a)，把上述选定转基因细胞系从第一代培养到第六代。 然后利用PCR方法验证各代的HA-5-HT6R基因是否出现特异表达(参照图2b)。检查结 果发现本专利技术的细胞系可稳定表达HA-5-HT6R，2008年09月12日把上述经过验证的细胞 系寄托到韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line ResearchFoundation)(寄托编号 KCLRF-BP-00187)。 在本专利技术的较佳实施例中，按照时间顺序对本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系 进行了5_羟色胺(5-HT)处理，确认了 ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 的磷酸化增加(参照图3a)，可知上述细胞系所表达的HA-5-HT6R在细胞内部正常地发挥功 能。上述细胞系受到5-HT与EMD386088的剌激后增加了 ERK的磷酸化现象，SB258585则 减少其效果(参照图3b)。把可以表达嵌合体Gal5蛋白质的载体与脂质体基因感染到本 专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系后利用5_HT给与剌激，然后再与表达5_HT6R的细胞系 的细胞内部钙流入情形进行比较，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及图 5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。 在本专利技术的较佳实施例中，分别在HA及大韩民国公开专利第2008-0004994号确 认为5-HT6R的结合蛋白质的Fyn使用特异抗体，可以观察到本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的 细胞系细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在 细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 在本专利技术的较佳实施例中，对于本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表 达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较后发现，由于本专利技术稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系 (参照图6)。本专利技术的细胞系是寄托编号为KCLRF-BP-00187的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 上述HA在细胞系以连接5-HT6R的形态表达并位于细胞表面的外部，可以利用上 述HA选择性地检查表达在细胞表面的5-HT6R。 上述转导可以在下列方法中选择一个方法后进行在脂质体(Lipofectamine)、 Dojindo公司的Hilymax、 Fugene、 jetPEI、 Effectene及DreamFect所组成的群中选 择某一商业化的转导用试药的方法；利用磷酸钙(calcium-phosphate)、正电荷型高分 子、微脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞系，含有Ｎ端连接ＨＡ的５－ＨＴ６Ｒ基因构建体的载体被转导到宿主细胞而稳定表达ＨＡ－５－ＨＴ６Ｒ的细胞系。
【技术特征摘要】
KR 2008-9-29 10-2008-0095258一种细胞系，含有N端连接HA的5-HT6R基因构建体的载体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。2. 根据权利要求l所述的细胞系，其特征在于上述细胞系以寄托编号 KCLRF-BP-00187寄托。3. 根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于上述转导可以在下列方法中选择一个 方法后进行在月旨质体、Dojindo公司的Hilymax， Fugene， jetPEI、Effectene及DreamFect 所组成的群中选择某一商业化的转导用试药；利用磷酸钙、正电荷型高分子、微脂粒、纳米 粒子、核转染、电穿孔法、热冲击、磁珠转染的方法；以及利用反转病毒的方法。4. 根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于上述宿主细胞在HEK293、C0S7、CH0-K1 及CH0-G5A所组成的群中选择。5. —种5-HTeR配体高效率检索方法，包括下列步骤 步骤l，利用受检化合物处理权利要求1的细胞系； 步骤2，测定上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少 5-HT6R活性的受检化合物。6. 根据权利要求5所述的高效率检索方法，其特征在于权利要求5中步骤1的受检 化合物在天然化合物、合成化合物、RNA、 DNA、多肽、酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真 菌的代谢产物及生物活性分子所组成的群中选择一个...
【专利技术属性】
技术研发人员：林惠媛，崔己贤，尹炯文，文东民，
申请(专利权)人：韩国科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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