本发明专利技术公开一种人白细胞介素１８的制备方法，属于白细胞介素。其是在ｐＨ至６．０发酵基础盐培养基中培养包含可复制表达载体的毕赤酵母菌株，２８－３０℃发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素１８的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素１８。本发明专利技术所制备人白细胞介素１８，其结构和生物学特性同国外大肠杆菌表达的ｒｈＩＬ－１８相同；而且产品质量稳定，纯度达到９７％左右，发酵液中ｒｈＩＬ－１８含量可达２０２ｍｇ／Ｌ，产率高，适合于产业化，为实现工业化生产奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及白细胞介素，具体地说，是一种应用DNA重组技术利用 曱基营养酵母实现的。 技术背景白细胞介素18(IL-18)又称IFN-V诱导因子(IGIF)，是新近发现的 前炎症细月包因子(proinflammatory cytokine),它在才几体的免疫和免 疫反应中起重要作用。迄今为止，已有人、小鼠、大鼠、狗、猪、马、牛U个种系的8种IL-18被克隆。人白细胞介素18基因编码193氨基酸前体蛋白，与鼠IL-18有65。/。同源 性。氨基酸系列包括了IL-1信号肽系列。IL-18可诱导TNF、 IL-12、 Fas 配体、某些激酶的基因表达及合成，参与非特异性免疫及特异性免疫。 试验证明IL-18通过细胞毒作用抑制肿瘤生长。实验还提示在脑胶质瘤患 者的肿瘤中直接注入IL-18以控制肿瘤生长不失为一潜在的治疗途径。 IL-18结合蛋白能降低恶性肺瘤细胞与肝内血管内皮的粘附，可有助于肝 转移的辅助治疗，并在胂瘤免疫监测中起重要作用。巴斯德毕赤酵母(户/c力/s ，Wor&)系统是近十余年来发展很快的 极具潜力的一种真核表达系统，现已被普遍用于表达许多有活性的蛋白 质。由于毕赤酵母表达系统是真核表达系统，所以完成真核生物特异的 蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程，并且具有发酵方法成熟、 发酵密度高、培养筒单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌、以 及表达效率高、表达产物易于纯化等优点，非常适合于大规模发酵生产 重组蛋白，展现了其在生物制药领域的广阔应用前景。毕赤酵母乙醇氧化酶基因是一个曱醇诱导表达的严格调控 基因，启动活性高，加入曱醇后可以迅速启动转录，而且N-糖基化方式 更接近高等真核生物。a-交配因子信号肽部分已被广泛用于酵母中合成 和分泌异源蛋白质。 .J I顏unol. 156 (1996) 4274-4279报道了 在大肠杆菌和哺乳动物 细胞中表达了人白介素18及变异体，人白介素18以包涵体的形式表 达，其纯化方法j^次采用疏水层析(pheny]-Sepharose),阴离子交换 层析(DEAE-S印lmrose)，凝胶层析(Superdex 75)，反相疏水层析(C4)等 方法，经纯化后SDS-PAGE检测纯度达到90°/。左右。《重组人比-18在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用》，中国免疫学 杂志，2006， 22, 141-144,才艮道了人白V卜素18以包涵体的形式在大肠3杆菌胞内表达。表达产物经冰浴后离心，将重组hlL-18包涵体沉淀经充 分洗涤后用8mol/L尿素溶解，经复性、透析和G50层析柱分离纯化后蛋 白的纯度达到90%左右。中国专利101177454公开了 IL-18突变体多肽及制备及用途，其 是利用PCR定点突变技术，构建人由介素18突变体(hlL-18),克隆入含 PfP!^启动子的温控载体，并在大肠杆菌中高效表达。利用表达的hlL-18突变体D134R治疗由 IL-18造成损伤的疾病。中国专利1634569公开了一种动物干扰素基因工程生物活性制 剂，是以基因工程干扰素及其诱导因子白介素18和包被调节因子为原 料制成，各成分按生物活性效价所占比例如下基因工程干扰素5X105 活性单位/ml,白介素18X102活性单位/m1,包被调节因子10活性单位 /ml。本专利技术能够显著增强动物机体免疫机能，快速、有效地消灭、净化 侵入动物体内的病毒，提高动物群的生物安全性，减少病毒性传染病的 发生及其给养殖户造成的经济损失，保障畜产品的卫生安全，促进动物 养殖业的高效稳定发展。 .中国专利1777807公开了一种利用角质形成细胞产生白介素18诱 导现象阻碍剂的筛选方法、特异性皮炎样症状的诱导方法及利用，利用 由角质形成细胞(KC)产生白介素18 (IL-18)的诱导现象，并可以适用于特 异性皮炎(AD)及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的各种 方法及其利用方法。例如通过将来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A (SpA) 涂敷于小鼠等的皮肤，或将产生AD样的炎症性皮肤病变的皮肤片移植至 小鼠等，从而可以再现AD样的病变中形成的血清中高水平的IgE表达。 由此，例如可以筛选诱导KC所导致的IL-18的产生的阻碍剂。目前，IL-18的制备主要在原核表达体系，但是，由于存在原核表达 体系产量低和复性得率低等一些问题，使其成本较高。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决IL-18的如j备产量低和复性得率低、成本较高 等问题，而提供一种在真核表达体系毕赤酵母中表达的人白细胞介素18 的制备方法。一种，其是在发酵基础盐培养基中培养包含可复制真核表达载体的毕赤酵母菌株，发酵扩增菌体后，将分泌表 达重组人白细胞介素18的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素18。所述的，其表达载体携带编码人白细胞 介素18的基因。所述的，其表达载体携带编码人白细胞介素18的基因，是将PCR扩增得到含hIL-18成熟肽基因片段，酶切后 得到质粒pPICZaC/hlL18,经电转化至新鲜制备的甲基营养型巴斯德毕赤 酵母感受态细胞X-33中；重组阳性克隆pPICZaC/IL18/X-33接种于函GY 中培养，离心、弃上清，复用B画Y培养基悬浮细胞，加iooy。曱醇至终浓 度为5mL/L诱导重组蛋白表达获得的。所述的，其发酵基础盐培养基pH6. 0， 28-30。C中发酵扩增菌体密度达220g/L左右时曱醇诱导表达，甲醇最终 的流加速度在18ml/h,调节通气量和转速维持溶解氧(DO值)在30-35%， 发酵时间为48h。所述的，其发酵基础盐培养基中包含有 微量元素PTM1 4. 35nil/L，生物素0. 6mg/L。所述的，其发酵基础盐培养基中包含有 微量元素PTM1 4. 35ml/L，生物素0. 6mg/L，蛋白胨0. 5%。所述的，其发酵扩增菌体过程中，DO值 在30-32%。本专利技术把hlL-18成熟肽连在a -交配因子信号肽的C-端，AOXI启动子 控制下a-交配因子信号肽引导hlL-18成熟肽在毕赤酵母中分泌表达。设 计时，为了得到不带有His-tag的蛋白，在扩增hlL-18片段时在其下游引 物引入终止密码子，这使得纯化相对困难，但得到的hlL-18由于没有多 余的氨基酸，也便于以后的动物实验研究。专利技术选择适合真核表达体系巴斯德毕赤酵母来表达hIL-18。此表达 体系既具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点， 又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以且生长速度快，培养成分简单，稳定、高产率、能适应工业化生产的需要，并为以后开展其体内或体外 生物学活性奠定了良好的基础。本专利技术经过两步层析纯化纯度达到97% 以上，其产量约为202mg/L。 附图说明图1是PCR产物和重組质粒pPICZaC/hlL18的酶切鉴定；图2是rhlL-18的SDS-PAGE检测培养上清中总蛋白的表达；图3是rhIL-18的Western blot分析；'图4是经过各步纯化的rhIL-18 SDS-PAGE分析;图5是rlL18协同11-2诱导PBMCs分泌IFN-y;图6 rIL-18和IL-2诱协同促进NK细胞的细胞毒活性。具体实施例方式一、方法二 -1、 hlL-18基因的克隆及载体构建提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人白细胞介素１８的制备方法，其特征在于：在发酵基础盐培养基中培养包含可复制真核表达载体的毕赤酵母菌株，发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素１８的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素１８。
【技术特征摘要】
1.一种人白细胞介素18的制备方法，其特征在于在发酵基础盐培养基中培养包含可复制真核表达载体的毕赤酵母菌株，发酵扩增菌体后，将分泌表达重组人白细胞介素18的上清液超滤浓缩，分离纯化、回收人白细胞介素18。2. 根据权利要求1所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于 所述表达载体携带编码人白细胞介素18的基因。3. 根据权利要求2所述的人白细胞介素18的制备方法，其特征在于 表达载体携带编码人白细胞介素18的基因，是将PCR扩增得到含hIL-18 成熟肽基因片段，酶切后得到质粒pPICZaC/hlL18,经电转化至新鲜制备 的曱基营养型巴斯德毕赤酵母感受态细胞X-33中；重组阳性克隆 pPICZaC/IL18/X-33接种于BMGY中培养，离心、弃上清，复用B固Y培养 基悬浮细胞，加100%曱醇至终...
【专利技术属性】
技术研发人员：任秀宝，刘虹，杨莉莉，魏枫，于津浦，李慧，郝希山，
申请(专利权)人：天津医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：12[]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。