一种提高基因重组人凝血因子Ⅷ表达量的方法技术

本发明专利技术通过分子生物学技术，构建含弱化的内部核糖体进入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ，简称为“ＩＲＥＳ”）序列及双重筛选标记的新型表达载体，本载体可用来重组表达人凝血因子Ⅷ，通过稳定表达株的全面筛选，能够有效地提高凝血因子Ⅷ在哺乳动物细胞中的表达量。

A kind of improved methods to measure the recombinant gene expression of human coagulation factor

The present invention by molecular biology technology, constructed with the weakening of the internal ribosome entry site (internal ribosome entry site, referred to as \IRES\) a novel expression vector sequence and double selection marker, the carrier can be used to express recombinant human coagulation factor VIII, comprehensive screening lines by stable expression, can effectively improve the expression of coagulation factor VIII in mammalian cells.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高基因重组人凝血因子雨表达量的方法，尤其涉及一种 在哺乳动物细胞中^是高基因重组人凝血因子预表达量的方法。
技术介绍
凝血因子環(Factor雨-related Antigen,简称为"FV1I1")是一血浆高分 子糖蛋白，由2332个氨基酸残基组成，凝血因子糧在内源性凝血体系中起了十 分重要的作用，它是激活凝血因子IX的辅助因子。FVI1I基因定位于Xq28,全长 186kb,由26个外显子和25个内含子组成。体内凝血因子VHI的数量不足或质量 异常将导致A型血友病。A型血友病是一种常见的X性染色体连锁遗传性出血性 疾病，在男性中的发病率为1:10， 000。点突变，小的基因缺失引起轻度FVI11缺 乏；终止密码子，大的基因缺失、插入、移位、无义突变往往引起严重的FVI1I缺 乏和临床表型。已证实FVlll 22内含子倒位突变引起FV1I1严重缺乏是45%的重型血友病a的分子发病机制，最近在1%的重型血友病a中还发现Fvni内含子i倒 位突变。目前对该病的主要治疗方法是从人血浆中提取的浓缩F雨制剂。但经常输入血液制品，患者极易感染病毒性肝炎及爱滋病等传染性疾病，治疗费用亦十分昂贵，在发达国家， 一个病人每年的治疗费用通常在美金10，000元以上。同时，由于Fvni极不稳定，且在血浆中的含量甚微，i升血浆仅含150微克Fvni，而且从冰冻血浆中提取F预的效率不高，因此目前提供的FVin浓制剂仅可用于治疗， 而极少作为常规预防用药。另外，有些患者容易对FV1U浓制剂产生急性过敏反应， 且有15 %患者会产生FVffl抗体，更加增加了治疗难度。自1984年FV1U cDNA克隆以来，已分别在CHO, 3T3等体系中成功地获得有 生物活性的rF雨，FDA已经批准应用于临床。初步的临床试验表明重组FV111具3有与血液来源的f雨相同的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的 出血倾向，临床得到了满意的结果。Fvin在体外的表达量明显低于与其性质类似的基因，如Fvni的表达水平只有 fix的1%,这说明细胞内存在对Fvni表达的负调控机制，使Fvin在细胞内的水平保持在一较低的状态。这可能是机体对F雨需求的反映，但对通过体外重组表达Fvni来讲是一主要障碍。除此之外，目前国际上对血友病的基因治疗的尝试中也发现维持F雨的表达量在治疗水平有较大的难度，其原因也是人工构建的FVIII表 达体系中F雨表达量不能满足治疗所需.这对大规模工业生产质优、价廉的FV1II造成了很大的困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过基因的改建，有效地提高在哺乳动物细胞中的Fvni的表 达量，从而构建新型的重组Fvin表达质粒，建立表达体系，并进行稳定表达林的 全面筛选。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种提高重组人凝血因子vni表达量的方法，包括如下步骤将内部核糖体进入位点序列IRES进行弱化处理；弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含 有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启 动子。优选的，所述筛选标记基因是二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因， 所述表达载体是pIRES-DHFR或pIRES-GS。进一步的，还包括通过氨曱喋呤或MSX加压扩增筛选标记基因两翼的基因。进一步的，所述弱化处理是指通过双顺反子载体将筛选标记基因二氢叶酸 还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因连在内部核糖体进入位点序列IRES的3'端， 筛选标记基因的表达水平得到降低。进一步的，还包括构建不同的凝血因子雨表达系统，包括Bdomain缺失但 包含新颖的Linker序列的Vni因子,和凝血因子Vin重、轻链共表达的vin因子,并从中筛选合适的工程细胞株。本专利技术通过含弱4匕的内部核斗唐体进入4立点(internal ribosome entry site, 简称为"IRES")序列的含有双重筛选标记的表达载体来表达重组FVin，极大地 简化筛选过程，提高筛选效率，提高获得高表达稳定抹的概率，即经过一次单克 隆筛选，即可获得大量稳定表达细胞抹，单克隆细胞的阳性率达到95%。附图说明图1是本专利技术中具有双重筛选标记的表达载体pIRES-DHFR/GS示意图。 图2是不同的FVin表达质粒的构建示意图。图3是不同的FVIII表达质粒分别克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图。 图4是FV1I卜HC/F雨-LC双表达质粒示意图。具体实施例方式围绕FV111表达水平低的问题，人们进行了大量的实验研究，以期提高其表达 量。FV11I及其衍生物在真核表达研究结果表明F雨(AB)在Cos-7细胞中的表达 量高于全分子的FVlll，且高于国外文献报；F预的表达有一定的组织特异性，在肝 癌细胞抹中的表达量最高，COS-7和CH0细胞次之，而在肺细胞中的表达量最 低；FV111重、轻链分子在真核细胞CHO中的共表达，F糧表达量有明显增加，是F VIII (AB)的3倍；将FVIH (AB)与vWF共同表达，FV11I的表达量也有明显增加。弱化技术，即通过有目的改造使得外源目的表达基因3'端下游的选择标记 基因的翻译起始效率大大降低，基因表达被弱化。因此，提高外源基因的表达水 平可以通过弱化选择标记基因表达,提高外源基因扩增水平来达到。因此，提高外源基因的表达水平可以弱化选择标记基因表达，提高外源基因 扩增水平来达到。弱化选择标记基因的表达，可使得在使用与常规的表达载体 相同的选择压力时，选择标记dhfr基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也相 应得到提高。如一种双顺反子载体将dhfr基因连在外源基因的3'端，从而位 于外源基因3'端下游的dhfr基因的翻译起始效率大大降低，dhfr基因表达净皮 弱化。图1是本专利技术中具有双重筛选标记的表达载体pIRES-DHFR/GS示意图，如 图1所示，本专利技术采用含内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite, IRES)序列的有双重筛选标记的表达载体一-pIRES-DHFR/GS, 该载体利 用弱化的IRES连接目的基因和筛选标记基因一二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或谷 氨酰胺合成酶基因(gs)，两个基因共用一个启动子，两段基因同时得到翻译， 在翻译过程中核糖体至第一个基因终止密码子时，从mRNA上解离下来，但由于 存在IRES序列，核糖体又能自动结合mRNA，直接翻译IRES后的基因。同时由于 本载体使用的IRES序列经弱化处理，第二个基因的表达水平(DHFR或gs)是前 一个基因即目的基因的1/10,如果细胞系要在含MTX或MSX的培养基中生存， 必须高水平表达二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或谷氨酰胺合成酶基因(gs),这样 弱化的IRES前的目的基因相应高水平的表达。此外，由于MTX或MSX加压可以 扩增DHFR或gs两翼的基因，经过多轮加压并提高加压筛选浓度，可以进一步 提高目的基因的表达量。图2是不同的FVIII表达质粒的构建示意图，图3是不同的FVIII表达质 粒分别克隆进入pIRES-DHFR/GS的示意图，图4是FVIII-HC/FVIII-LC双表达 质粒示意图，如图2、图3、图4所示，构建不同的FVin表达质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高基因重组人凝血因子Ⅷ表达量的方法，其特征是：包括如下步骤：将内部核糖体进入位点序列ＩＲＥＳ进行弱化处理；弱化后的所述序列一端连接目的基因，另一端连接筛选标记基因，构建含有双重筛选标记的表达载体，其中，所述目的基因和筛选标记基因共用一个启动子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何胜祥，王志强，
申请(专利权)人：上海同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]