一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法。本发明专利技术通过基因合成的方法得到编码人凝血因子Ⅻa活性区域的DNA，通过毕赤酵母进行扩增，将酵母培养液离心透析、滤膜压滤，再通过以Ni-NTA为介质的柱层析纯化得到重组人凝血因子Ⅻa。本发明专利技术降低了人凝血因子Ⅻa的生产成本，产品活性高于从血液中提取的凝血因子Ⅻa。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组人凝血因子Ⅻa的生产方法，步骤如下：（1）通过基因合成的方法得到编码人凝血因子Ⅻa活性区域的DNA，将得到的DNA克隆到pPICZαB载体中，构建pPICZαB?凝血因子Ⅻa载体，转化大肠杆菌DH5α；所述活性区域指人凝血因子Ⅻa氨基酸片段354?615；（2）利用质粒抽提方法抽提重组质粒pPICZαB?凝血因子Ⅻa；将重组质粒pPICZαB?凝血因子Ⅻa进行SacⅠ单酶切线性化，并回收后待用；（3）接种毕赤酵母X33或GS115，将培养物转移至YPD液体培养基中，在27?30℃，200?250rpm的条件下培养至OD600=1.3～1.5，4℃离心，依次用冰无菌水及冰的1M山梨糖醇洗涤重悬沉淀；（4）取上述菌液，与线性化DNA混匀，点击转化后加入预冷过的1M的山梨糖醇，转移至无菌微量离心管；离心后取20?200μL菌液涂布至YPDSZ平板，30℃孵育72～96h，直至菌落出现，点种保存；筛选高拷贝阳性克隆菌株进行培养，培养结束后离心收集上清液；（5）将步骤（4）中收集得到的上清液经透析、0.45μm的滤膜压滤，再通过以Ni?NTA为介质的柱层析纯化，得到重组人凝血因子Ⅻa。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱冬明，胡亮，李立炯，
申请(专利权)人：维亚生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：