一种体外化合物安全性评价方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种体外化合物安全性评价方法，该安全性评价方法是对原代细胞进行分离培养后，将待检化合物与分离培养好的原代细胞共同孵育，ＭＴＴ法测原代细胞的相对活力。本发明专利技术还公开了上述体外化合物安全性评价方法在化妆品、食品、新药物或未知性质化合物的体外安全性评价中的应用。本发明专利技术体外化合物安全性评价方法简单易行，周期短，检测效率高，花费低廉，结果稳定可靠，避免了环境污染，具有可观的应用前景。

Safety evaluation method of in vitro compound and application thereof

The invention discloses a compound in vitro safety evaluation method, the method of safety evaluation of primary cells were cultured, isolated and cultured to be detected compounds with good primary cells were incubated with MTT method to measure the relative activity of primary cells. The invention also discloses the safety evaluation method of the compound in vitro, which is applied to the in vitro safety evaluation of cosmetics, food, new drugs or unknown property compounds. The method for evaluating the safety of the compound in the invention has the advantages of simple and easy operation, short cycle, high detection efficiency, low cost, stable and reliable result, environmental pollution prevention, and considerable application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药理毒理检测领域，具体涉及一种体外化合物安全性评价方法及其应用。
技术介绍
长期以来，药物临床前安全性评价是依赖于动物实验。但是，从经济角度考虑，动物实验耗时，费用高。动物保护主义也对大量使用实验动物提出了质疑。2007年6月，欧盟委员会关于化合物审批注册的立法正式生效，约30000种化合物有待检测，若全部使用动物实验，估计约需3900000只动物，所以，欧盟倡导使用体外方法替代动物实验，在化妆品和对皮肤剌激性试验中已经率先采用3R实验(Refinement, Reduction, R印lacement)，即优化、减少、替代动物实验。3R原则涉及到化学品、化妆品、药品、生物制品和环保等几乎所有涉及到动物实验的安全性评价领域。自2009年3月起，欧盟禁止使用动物进行化妆品急性毒性、眼剌激和过敏试验，同时规定禁止在欧盟范围内销售使用动物实验的化妆品。为与国际接轨，避免基于法律的贸易壁垒，我国也亟待探索可靠的动物实验替代方法用于药物及化合物安全性评价。利用体外培的细胞进行实验研究，具有周期短、高通量、价格低廉、重复性好等优点。 美国国立职业安全与卫生研究所及欧盟动物替代方法研究机构等机构多使用3T3， NHK等细胞株进行药物的毒性安全性评价。但未有应用原代神经元、心肌细胞毒理药理实验数据建立的LD50急性毒性预测模型，而应用原代细胞在药物体外安全性评价中具有很大的优势。 原代细胞培养是指从活体中获得细胞，在体外条件下进行第一次培养。原代培养的神经元细胞不分裂、增殖，相对于细胞株具有细胞不变异、更接近正常人体内状况的优点。神经元体外培养是研究神经细胞形态及病理变化的常用方法，同时也是研究各种脑损伤和脑缺血等病理变化的重要手段，所以神经细胞原代培养已逐渐成为研究中枢病变的重要技术。利用原代培养神经元模型用于评价化合物、药物毒性已经成为判断化合物急性毒性，神经系统选择性毒性、神经系统慢性毒性的平台。因此，应用神经元作为药物或化合物神经毒性检测与筛选相较于细胞株(如PC12、HEK293等细胞株)更具说服力。 同样，利用原代心肌细胞用于评价药物或化合物的心脏毒性也具有不可替代的优势，原代培养成功的心肌细胞具有自律性，在显微镜下可以看到明显的心肌细胞的搏动，作用于心血管系统的药物可以直接接触心肌细胞可以用于心脏毒性评价等。 综合上述，在药物及化合物安全性评价领域，应用原代培养的细胞建立的药物急性毒性预测模型将会是可靠的动物实验替代方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术的不足，提供一种简单易行，周期短，花费低廉的体外化合物安全性评价方法。 本专利技术的另一 目的在于提供上述体外化合物安全性评价方法的应用。 本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现 —种体外化合物安全性评价方法，包括如下步骤 (1)原代细胞分离培养； (2)将待检化合物与原代细胞共同孵育； (3)检测细胞活力。 其中，所述原代细胞优选大鼠原代皮质神经元细胞或大鼠心肌细胞。因为神经元 细胞不分裂、增殖，相对于细胞株具有不易变异、更接近正常人体细胞的优点；心肌细胞具 有自律性，可用于心血管系统药物的心脏毒性评价。 所述大鼠原代皮质神经元细胞培养步骤如下无菌分离大鼠大脑皮质，移入离心 管中，静置去上清，加入胰酶消化3 10min后，终止消化；将细胞液离心，去上清后重悬，接 种于96孔板进行常规培养。 大鼠原代皮质神经元细胞培养优选为如下步骤无菌分离新生SPF级Wistar大 鼠大脑皮质，以解剖液洗涤1 2次，于解剖液中用眼科剪剪碎脑组织至1咖3大小，移入 离心管中，静置，去上清，加入O. 25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至装有少量小牛血 清的离心管中，终止消化，反复数次至消化完全；汇集全部液体过180目筛后移入离心管， 100rpm离心7min后，弃上清，用含5mllOX的胎牛血清和5%马血清的DMEM培养液重悬细 胞，细胞计数后调整细胞密度为5X105，以每孔100 iU的体积接种于铺好多聚赖氨酸的97 孔板中，于37°C 、5 % C02、 100 %湿度的条件下进行细胞培养；24h后以含2% B27的神经元 细胞培养基换液，48h后加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷，以后每三天换液一次。培养了 7 10d的细胞最适合用于评价化合物的安全性。 所述大鼠心肌细胞培养步骤如下无菌分离大鼠心脏，取心尖组织移入离心管中， 静置去上清，加入胰酶消化3 10min后，终止消化；将细胞液离心，去上清后重悬，接种于 96孔板进行常规培养。 大鼠心肌细胞培养优选为如下步骤无菌分离新生SPF级Wistar大鼠心脏，以 PBS洗涤4 5次，剪取心尖组织，于PBS中用眼科剪剪碎组织至lmm3大小，移入离心管中， 静置，去上清后，加入O. 25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至装有少量小牛血清的离心 管中，终止消化，反复数次至消化完全；汇集全部液体过180目筛后移入离心管，100rpm离 心7min后，弃上清，用含5ml 10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数后调整细胞 密度至5X105，以每孔100 iil的体积接种于96孔板中，于37°C、5% C02、 100%湿度的条件 下进行细胞培养；48h后加入细胞分裂抑制剂Brdu，以后每三天换液一次。 所述待检化合物与原代细胞共同孵育的时间优选为24h。 所述检测细胞活力的方法皆为本领域内常见方法，如SRB法、LDH法等，优选为MTT法。 本专利技术体外化合物安全性评价方法在化妆品、食品、新药物或未知性质化合物的 安全性评价中的应用如下 (1)化妆品、护肤品的快速、高通量毒理学安全性评价； (2)防治烧伤、皮肤病、性病、外伤等外用药物的快速安全性评价； (3)药物致畸形、致突变的评价；4 (4)新药物或新化合物的快速、高通量毒性筛选与确认； (5)未知性质化合物快速毒性鉴定； (6)农药对哺乳动物细胞的毒性安全性评价； (7)食品的研发、检验和质量控制中的安全性评价。 本专利技术体外化合物安全性评价方法对于不同性质、不同用途的药物或化合物毒性 或敏感性不尽相同，因此，既可独立评价化合物，亦可与其它检验方法相辅相成，综合评价 药物或化合物的安全性。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果 本专利技术体外化合物安全性评价方法通过心肌细胞或神经元细胞的培养，将待检化 合物作用于上述两种细胞中的一种来评价其安全性，该评价方法简单易行，周期短，检测效 率高，花费低廉，避免了环境污染，可以用于化妆品、护肤品、药物、化合物、未知性质化合 物、农药、食品等的安全性评价，具有可观的应用前景。附图说明 图1为17种受试化合物作用于原代神经元细胞时，用MTT法测得的lg(IC50)与 lg(LD50)间的相关性; 图2为20种受试化合物作用于原代心肌细胞时，用MTT法测得的lg(IC50)与lg(LD50)间的相关性; 图3为培养5天的心肌细胞； 图4为正常心肌细胞HE染色的形态学观察照片； 图5为倒置显微镜下与普罗帕酮共孵育24h的心肌细胞照片。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何限定。 实验试剂特级胎牛血清(TBD)，优级胎牛血清(TBD) ， D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外化合物安全性评价方法，其特征在于包括如下步骤：　　（１）原代细胞分离培养；　　（２）将待检化合物与原代细胞共同孵育；　　（３）检测细胞活力。

【技术特征摘要】
一种体外化合物安全性评价方法，其特征在于包括如下步骤(1)原代细胞分离培养；(2)将待检化合物与原代细胞共同孵育；(3)检测细胞活力。2. 根据权利要求l所述的体外化合物安全性评价方法，其特征在于步骤(1)中，所述原 代细胞培养包括大鼠原代皮质神经元细胞培养或大鼠心肌细胞培养。3. 根据权利要求2所述的体外化合物安全性评价方法，其特征在于所述大鼠原代皮质 神经元细胞培养步骤如下无菌分离大鼠大脑皮质，移入离心管中，静置去上清，加入胰酶 消化3 10min后，终止消化；将细胞液离心，去上清后重悬，接种于96孔板进行常规培养。4. 根据权利要求3所述的体外化合物安全性评价方法，其特征在于所述大鼠原代皮 质神经元细胞培养步骤如下无菌分离新生SPF级Wistar大鼠大脑皮质，以解剖液洗涤 1 2次，于解剖液中用眼科剪剪碎脑组织至1咖3大小，移入离心管中，静置，去上清，加入 0. 25X胰酶，37t:消化5min，吸出上清液至装有少量小牛血清的离心管中，终止消化，反复 数次至消化完全；汇集全部液体过180目筛后移入离心管，100rpm离心7min后，弃上清，用 含5ml 10%的胎牛血清和5%马血清的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数后调整细胞密度为 5X105，以每孔100 iil的体积接种于铺好多聚赖氨酸的97孔板中，于37°C、5% C02、100% 湿度的条件下进行细胞培养；24h后以含2% B27的神经元细胞培养基换液，48h后加入细 胞分裂抑制剂阿糖胞苷，以后每三天换液一次。5. 根据权利要求2所述的体外化合物安全性评价方法，其特征在于所述大鼠心肌细胞 培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧林泉，巫玮，潘琴，潘雪刁，石磊，郭姣，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]