一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定技术

一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定，其工艺步骤是：原料→高压气流破碎→过筛→微波辅助溶剂萃取→过滤→真空酶提→过滤→滤液（滤渣重复提取的滤液合并）→离心→径向高效色谱分离→超滤→真空浓缩→冷冻干燥→茶多糖ＴＧＣ，本发明专利技术的技术效果是：提高了茶多糖含量及降血糖活性，缩短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性。

Separation, purification, preparation method and structure identification of tea polysaccharide

A separation of tea polysaccharide purification and preparation method of structure identification, the process comprises the steps of: material, high pressure airflow crushing, sifting, microwave assisted solvent extraction, enzyme extraction, filtration, vacuum filtration, the filtrate (filtrate residue repeat extraction), centrifugation, ultrafiltration, chromatography, radial separation, vacuum concentration to freeze drying, tea polysaccharide TGC, the technical effect of the invention are: to improve the content of the tea polysaccharide and the hypoglycemic activity, shorten the extraction time, reduce energy consumption and effective preservation of the biological activity of the tea polysaccharide.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种茶多糖的制备方法，尤其涉及一种茶多糖的分 离纯化制备方法及结构鉴定。Ff京伎不茶叶是我国的大宗农副产品，现有茶园面积约ioo万公顷，年产茶叶约60万吨左右，其中约有10万吨左右的粗老茶叶滞消或积压， 如果不考虑这些制茶副产品的综合利用，将造成很大的资源浪费和经 济损失。自20世纪80年代始，国内外学者对茶叶中所含的多糖复合 物进行了大量的研究，发现茶多糖具有增加机体免疫能力、降血糖、 降血脂和减少动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗辐射及抗炎等多种生物活性。 关于茶多糖提取的专利报道近年来主要有张效林 一种从茶 叶中提取茶多酚副产咖啡碱和茶多糖的方法(申请号 200510042629.3)，李永泉从提取过茶多酚的下脚料中提取茶多糖 的方法(申请号03114898.0)，汪叔雄在茶叶中提取茶多酚及其 副产品的方法(申请号96113134.9)，严良荣粗、老茶鲜叶提取 多糖、多酚混晶工艺方法(申请号97109115.3)，黄宝生茶多糖 的提取方法(申请号01134065.7)，惠永正纯化茶多糖及提成方 法(申请号02110999.0)，江和源从茶叶中综合提取茶多糖、茶 多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法(申请号200410015905. 2)，汪东风 茶叶中有效成分综合制备工艺(申请号200310114694.3)，张守 政从茶叶中提取茶多酚、茶氨酸、茶多糖、茶色素的方法(申请 号200610055145. 7)，杨红武一种茶多糖及其制备方法和用途(申 请号200610125174. 6)，这些专利报道极大的丰富了茶多糖提取纯化 手段，但并没有从茶叶提取物中纯化出一种单一组分。本专利技术的特色在于从茶叶中茶多糖提取工艺中提高提取率、縮 短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性等目的，并且纯 化得到一个多糖和蛋白的缀合物组分(Tea Glycocongujate， TGC)，4并且对该组分的理化性质、分子量、氨基酸组成、单糖组成、 一级结 构和溶液中的构象等进行了系统的分析鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构 鉴定，该方法縮短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性。 本专利技术是这样实现的，其工艺步骤是1、 原料以粗老茶叶、低档茶叶或提取茶多酚后的茶叶废渣为 原料；2、 高压气流破碎将原料经50 — 6O。C干燥、一40。C冷冻等预处 理后，气流式超微粉碎对原料进行处理，其主要是通过气流的冲击、 剪切、碰撞和摩擦对物料进行粉碎，要求气源压力为5MPa，粉碎压 力为3 — 5MPa，从而使原料等活性成分的溶出量提高、粉体粒度减小， 以改善原料中茶多糖提取过程中得率低等问题。3、 过筛高压气流破碎后的原料进行分级过筛40—80目；4、 微波辅助溶剂萃取采用微波提取主要使原料细胞内温度迅速上升，细胞内液水份汽化产生的压力使细胞膜和细胞壁急剧破碎， 形成微小的孔洞，使可溶性物质快速溶出。微波辅助溶剂萃取最佳工艺条件为微波时间75秒，微波强度100%，固液比l: 15;5、 真空酶提采用CdlUbriXTML纤维素酶(含纤维素酶 1500NCU/mL、纤维二糖酶25CbU/mL)， Termamyl 耐温a-淀粉酶， 为保持茶多糖的活性，采用真空低温水提、酶提二次结合法提取茶多 糖。第一次在5(TC、固液比1:15、水提取30min，多糖提取率为2.33%， 粗多糖(干重)的提取率为6.82%。过滤后，滤渣用pH4.6的柠檬酸 一柠檬酸钠缓冲液加纤维素酶提取，酶提最佳工艺参数为55°C、固 液比1:14、酶用量2.2pL/g茶叶，120min;6、 径向高效色谱分离多糖的凝胶柱纯化将制备的初步纯化 茶多糖溶解于蒸馏水中(或直接用不经干燥的提取液)。过Sephadex G100凝胶柱(2.6x70cm)。用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以 0.1mol/LNaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管。逐管检测A28o自(蛋白质吸收峰)、A62。(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，浓縮，备用。SephadexG100凝胶湿法 装柱取一定量的SephadexG100凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸 馏水浸泡，在10(TC水浴中溶胀5到6小时，取出冷却后，于室温放 置24小时继续溶胀。溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气， 即可装柱。本专利采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏 水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱 的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面 始终处在水面以下。装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱 液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。HPLC鉴定纯度及其色谱条件的 摸索HPLC分析时，采用手动进样，每次进样量为20nL，洗脱流 速为0.5mL/min。样品溶液和洗脱液分别用0.80|Lim和0.45pm的滤膜 过滤。7、 超滤选用中空纤维材料，工作压力为28psi，料液温度为 29°C，料液pH为6.7，超滤处理40min，膜的渗透通量达最佳值为 9. 98L线8、 冷冻干燥冷冻干燥条件-80'C预冻8hr后，-8(TC真空冷冻 干燥6小时。，在本专利技术中，蛋白质含量测定方法如下实验使用了两种方法来测定TGC中的蛋白质含量(1)标准曲 线法以牛血清蛋白为标样，配制成lmg/mL的溶液，间隔吸取一定 体积标液于25mL容量瓶中定容，测定各浓度下标液在280nm处的 吸光度，作出工作曲线，得方程，同样测定样品在280nm处的吸收 值，代入方程计算样品蛋白含量。(2)仪器分析元素分析仪测定N 含量，再乘以6.25，即为蛋白质含量。在本专利技术中，氨基酸组成分析如下取TGC3mg，加6mol/L的HC1 5ml，脱气、封管，放入110。C的 恒温箱中保温24小时后，取出干燥，然后用0.02mol/L的HCl 0.5ml溶解，离心，取上清液用氨基酸自动分析仪测定。在本专利技术中，糖醛酸含量的测定如下硫酸一咔唑试剂的配制取40mg的咔唑，溶于80mL的含0.02mol四硼酸钠的浓硫酸中，.避光保存(用时临时配制)。配半乳糖醛酸标准液0.985mg/mL，取间隔体积标液于25mL容量 瓶中定容，从中取lmL液，加入8mL的硫酸一咔唑试剂于具塞试管 中，加塞混均后，10(TC保温45分钟，冷却至室温，在530nm处测 吸光度，以浓度对A作图，得工作曲线和方程。样液同上处理，通 过A值计算糖醛酸含量。在本专利技术中，茶多糖氨基酸组成如下茶多糖的盐酸消解产物，经氨基酸自动分析仪分析检测到17种 氨基酸(其中色氨酸由于样品量少而未检测)，列于表3。表3 Amino Acids and Content of TGC' Protein Part<table>table see original document page 7</column></row><table>TGC中，含有17种氨基酸，其中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、 甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)含量高，其总和占了氨基酸总量的 43%，胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、组氨酸(H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于按下述方法制备：　（１）原料：以粗老茶叶、低档茶叶或提取茶多酚后的茶叶废渣为原料；　（２）高压气流破碎：将原料经５０－６０℃干燥、－４０℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对原料进行处理，其主 要是通过气流的冲击、剪切、碰撞和摩擦对物料进行粉碎，要求气源压力为５ＭＰａ，粉碎压力为３－５ＭＰａ，从而使原料等活性成分的溶出量提高、粉体粒度减小，以改善原料中茶多糖提取过程中得率低等问题；　（３）过筛：高压气流破碎后的原料进行分级过 筛４０－８０目；　（４）微波辅助溶剂萃取：采用微波提取主要使原料细胞内温度迅速上升，细胞内液水份汽化产生的压力使细胞膜和细胞壁急剧破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物质快速溶出，微波辅助溶剂萃取最佳工艺条件为微波时间７５秒，微波强度１００ ％，固液比１∶１５；　（５）真空酶提：采用纤维素酶，耐温α－淀粉酶，为保持茶多糖的活性，采用真空低温水提、酶提二次结合法提取茶多糖，第一次在５０℃、固液比１∶１５、水提取３０ｍｉｎ，茶多糖提取率为２．３３％，粗茶多糖的提取率为６．８２ ％，以干重计，过滤后，滤渣用ｐＨ４．６的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液加纤维素酶提取，酶提最佳工艺参数为５５℃、固液比１∶１４、酶用量２．２μＬ／ｇ茶叶，１２０ｍｉｎ；　（６）径向高效色谱分离：茶多糖的凝胶柱纯化：将制备的初步纯化茶多糖溶解于 蒸馏水中，过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１００凝胶柱，用１０ｍｌ进样器逐滴将样液加入柱中，以０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ洗脱，流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ，自动分部收集仪每６ｍｉｎ收集一管，逐管检测Ａ２８０ｎｍ、Ａ６２０，收集含糖部分，浓缩，备用，Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　１００凝胶湿法装柱：取一定量的Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１００凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水浸泡，在１００℃水浴中溶胀５到６小时，取出冷却后，于室温放置２４小时继续溶胀，溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气，即可装柱，本专利采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面始终处在水面以下，装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。ＨＰＬＣ鉴定纯度及其色谱条件的摸索：ＨＰＬＣ分析时，采用手动进样，每次进样量为２０μＬ，洗脱流速为０．５ｍＬ／...

【技术特征摘要】
1、一种茶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于按下述方法制备(1)原料以粗老茶叶、低档茶叶或提取茶多酚后的茶叶废渣为原料；(2)高压气流破碎将原料经50-60℃干燥、-40℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对原料进行处理，其主要是通过气流的冲击、剪切、碰撞和摩擦对物料进行粉碎，要求气源压力为5MPa，粉碎压力为3-5MPa，从而使原料等活性成分的溶出量提高、粉体粒度减小，以改善原料中茶多糖提取过程中得率低等问题；(3)过筛高压气流破碎后的原料进行分级过筛40-80目；(4)微波辅助溶剂萃取采用微波提取主要使原料细胞内温度迅速上升，细胞内液水份汽化产生的压力使细胞膜和细胞壁急剧破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物质快速溶出，微波辅助溶剂萃取最佳工艺条件为微波时间75秒，微波强度100％，固液比1∶15；(5)真空酶提采用纤维素酶，耐温α-淀粉酶，为保持茶多糖的活性，采用真空低温水提、酶提二次结合法提取茶多糖，第一次在50℃、固液比1∶15、水提取30min，茶多糖提取率为2.33％，粗茶多糖的提取率为6.82％，以干重计，过滤后，滤渣用pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加纤维素酶提取，酶提最佳工艺参数为55℃、固液比1∶14、酶用量2.2μL/g茶叶，120min；(6)径向高效色谱分离茶多糖的凝胶柱纯化将制备的初步纯化茶多糖溶解于蒸馏水中，过Sephadex G100凝胶柱，用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管，逐管检测A280nm、A620，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂少平，谢明勇，刘伟，申明月，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]