蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，本发明专利技术提供了蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白的降解作用；本发明专利技术还提供了所述蚯蚓纤连蛋白酶用于治疗乙型肝炎的应用，尤其是对慢性乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化的预防和治疗作用；本发明专利技术还提供了一种药物，所述药物包含所述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。

Application of earthworm fibronectin in the treatment of hepatitis B

The invention belongs to the field of biotechnology, the invention provides earthworm fibronectin enzyme on fibronectin degradation; the invention also provides the earthworm fibronectin enzyme for the treatment of hepatitis B, especially on chronic hepatitis B, the effect of prevention and treatment of liver cirrhosis caused by hepatitis B; the invention also provides a the drug, the drug containing the earthworm fibronectin enzyme as active ingredient.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术的领域，具体地说，本专利技术提供蚯蚓纤连蛋白酶 降解纤维连接蛋白的应用，以及在乙型肝炎治疗中的应用。
技术介绍
乙型肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。 通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行。据有 关资料，肝炎检测阳性的患者己经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携 带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及 青壮年。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人 可转变为原发性肝癌，这些疾病对病人以及社会的危害更加严重。发病过程 一般来说，肝细胞受乙肝病毒入侵后，乙肝病毒本身并 不直接引起肝细胞的病变。乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生 存并在肝细胞内进行复制。病毒复制的表面抗原、e抗原和核心抗原都释 放在肝细胞膜上，激发人体的免疫系统来辨认，并发生反应。这种在肝 细胞膜上发生的抗原抗体反应可造成肝细胞的损伤和破坏，从而产生一 系列临床症状。治疗手段我国多数患者是在围生期或年幼时感染HBV造成免疫耐 受，往往形成慢性感染，这些患者需要积极而有效的治疗，否则可能发 展为肝硬化甚至肝癌，导致死亡。然而迄今尚无一种可靠的治疗方法能 清除或永久抑制HBV的复制，从而终止肝脏的炎症和坏死。慢性乙型肝 炎目前的治疗目标是①抑制HBV复制(HBsAg、 HBeAg消失)；②非 扩增法检测不出HBVDNA水平；③病情改善，ALT复常；④肝组织学 改善； 减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞肝癌的发生率。目前用于治疗乙肝的药物主要包括干扰素、核苷酸类似物等抗病毒药物和胸腺肽等 免疫调节药物。1. 传统干扰素与聚乙二醇干扰素干扰素目前仍是治疗乙型肝炎 的一线药物，它具有明确的疗程，疗效好，可使HBsAg消失和抗HBs 产生，无耐药性等优点，但是由于同时存在副作用较多、不能使用于失 代偿性肝硬化患者、注射治疗麻烦及代价昂贵等缺点而限制了其使用。 在美国，很多的医生倾向于选择核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝。2. 拉米夫定短期用拉米夫定对HBV DNA的抑制作用、HBeAg 转阴率、HBeAg血清转换率及血清ALT复常率均优于干扰素，而且服用 方便，可以用于失代偿性肝硬化及肝移植前后患者，但是其持续应答率 不及干扰素，而且存在一个较突出的耐药性问题，且随着服用时间的延 长，耐药性也会逐渐增加。3. 阿德福韦酯是一新型核昔(酸)类似物，口服阿德福韦酯是阿德 福韦的前体，能有效抑制乙肝病毒复制、改善组织学、延缓疾病进展成 肝硬化、肝功能失代偿及肝癌，它的耐药性发生低于拉米夫定，且对拉 米夫定耐药者有很好的治疗效果，但是长期服用有一定肾毒性，需定期 监测血清肌酐和血磷。4. 恩替卡韦是环戊酰鸟苷类似物，我国SFDA去年年底刚批准 用于慢性乙型肝炎的治疗。5. 其他其他还在进行n、 m期临床试验的药物有恩曲他滨、特必夫定、克拉夫定。6. 免疫调节治疗免疫调节治疗是治疗慢性乙型肝炎的重要手段之一，目前用于治疗乙型肝炎的免疫调节药物主要是胸腺肽。胸腺肽剌激T细胞，增强非特异性免疫功能，其不良反应小，耐受性好，使用安全，对于有抗病毒治疗指针，但不能耐受或不愿接受干扰素和核苷酸类似物 治疗的患者可选用胸腺肽。随着乙型肝炎发病机理研究的深入，研究工作者发现纤维连接蛋白在乙型肝炎发病过程中发挥着重要作用。纤维连接蛋白(Fibronectin， FN) 是一种存在于血液、体液及各种组织中的具有多种功能的糖蛋白，来源 于肝细胞，枯否细胞和内皮细胞，通过与整合素结合调节细胞间的粘附、免疫、凝血和血小板的聚集，另外在肿瘤与纤维化的发展与发病机制中， FN也起着重要的作用。一、 纤维连接蛋白的结构及功能FN按分布不同可分为两种， 一种是分布于血浆的血浆型FN(pFN)， 另一种是广泛分布于人体内细胞表面的细胞型FN(cFN)。 pFN是一种可溶 性的蛋白质，在血液中浓度很高。血液中的可溶性的FN大部分是由肝细 胞合成。cFN作为不溶性FN的一部分，可以掺入到细胞周围基质中，肝 脏中的FN主要由内皮细胞，贮脂细胞及枯否细胞分泌。FN分子可以结合 多种分子发挥其功能，如胶原蛋白、肝素、血纤维蛋白及细胞表面受体， 其中与细胞表面受体的结合主要是通过FN分子中的RGD序列。识别RGD 序列的一些粘合素分子都可以识别FN中的RGD序列，所以FN可通过RGD 与受体相连，从而发挥调节作用。FN还具有病毒结合活性，与甲型肝炎病毒(HAV)结合后，发生HAV 的屏蔽现象，可干预病毒检测的放免法，通过富含FN的血产品有助于肝 炎病毒的频繁传播。有学者发现人肝脏中的FN通过与HBV前S2区编码的 一特异抗原决定簇结合，从而使病毒在肝窦内循环时被肝细胞所吸收， 促进病毒对肝细胞的作用。同时，在肝纤维化及肝细胞癌时，FN在RNA 水平发生变化。二、 纤维连接蛋白与慢性肝炎、肝硬化HCV和HBV感染后常进展为慢性病毒性肝炎。慢性肝病尤其是活动 性病变，由于致病因素的持续作用和机体免疫功能失调，以致肝细胞持 续受损，纤维组织不断增生而导致肝硬化。Martinez-Hernandez等提出FN 在肝脏的纤维化过程中发挥重要的作用，可促使肝细胞分泌胶原，促进 成纤维细胞的趋化性，促进成纤维细胞及肝细胞等与胶原基质的粘附作 用。存在于成纤维细胞表面的细胞连结素，它与酸性粘多糖及胶原具有 很强的亲和性，以FN为核心，结合粘多糖及胶原成为三元复合体，做成 细网构造，被视为肝纤维化的基础。与正常人群相比较，慢性活动型肝 炎(CAH)患者中FN水平明显增加。血浆型FN绝大部分由肝细胞合成，炎症造成血浆中FN消耗导致血浆 中FN降低，FN减少则反映了肝细胞合成蛋白质功能的减退，故在肝硬化时，血浆FN水平则明显降低，然而在急、慢性肝炎时增加。Odenthal等 提出在肝纤维化的急性阶段及接近纤维化阶段，细胞型的FN mRNA表达 增加。Jamagin等用鼠急性肝损伤模型检测到，内皮细胞主要产生EIII-A 阳性的FN，相反被激活的贮脂细胞主要分泌EIII-B阳性FN。 Shigem等采 用免疫组化及原位杂交法检测到了在肝纤维化区细胞型FN(EIII-APR阳 性)沉积，提示细胞型FN在肝纤维化时起关键作用。在纤维化肝脏中，肝 细胞与非实质细胞中细胞型FN的mRNA表达增加，而且表达FN的细胞也 有所增加，细胞型FN在肝纤维化形成的早期发挥着重要的作用。 三、纤维连接蛋白与肝细胞癌细胞外基质(ECM)被认为在肿瘤、肿瘤侵袭及转移中发挥重要的作 用。不同分化的肝癌其ECM定位不同。FN、 FN受体(整合素a5与(31)及其 片段mAD2(恶性病变相关DNA连接蛋白2)的研究，提示整合素a5(31和FN 与肝癌分化有关，并影响肝癌的侵袭性与转移。现已证实FN参与慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生发展，主要通过选 择性剪切和改变与受体的结合来发挥调节作用。其在分子水平中的调控 机制仍不清楚，尚需进一步的研究。蚯蚓俗称地龙，其种类繁多，资源丰富。蚯蚓作为药物使用，在我 国已有1200多年的历史。最原始的方法是利用整个鲜蚯顿或干蚯顿；随 着发展，后来发现蚯蚓的药用价值与其中含有的多种化学成分有关。目 前已经分离到多种不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的应用。

【技术特征摘要】
1.蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的应用。2.权利要求1的应用，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.l。3. 权利要求1的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43， D91， S^(其上编号对应于SEQIDN0.1氨基酸序 列)组成的催化三联体。4.权利要求1或3的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。5.权利要求1或3的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，所述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQ IDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQ IDNO.IO， SEQIDNO.il， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQIDN0.14， SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。6.蚯躬l纤连蛋白酶用于制备药物的应用，所述药物用于预防或治疗与 纤维连接蛋白有关的疾病。7.权利要求6的应用，所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎，肝硬 化，肿瘤疾病。8. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l。9. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，其氨基酸序列具有H43， D91， S'88(其上编号对应于SEQIDN0.1氨基 酸序列)组成的催化三联体。10. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸 序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。11. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸 序列，所述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4，SEQIDNO,5， SEQIDN0.6， SEQIDNO,7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQIDNO.IO， SEQIDNO.ll， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列。12. 权利要求6的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQIDNO,3， SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6， SEQ ID NO.7 ， SEQ ID N0.8 ， SEQ ID NO.9， SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11 ， SEQIDN0.12， SEQIDN0.13， SEQIDNO.14, SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的单一组分使用。13. 权利要求6的应用，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：赫荣乔，王学清，陈岚，潘荣，肖蓉，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]