【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾内参基因组合及其筛选方法。
技术介绍
1、斜纹夜蛾spodoptera liturafabricius属鳞翅目夜蛾科，是世界性分布的重要害虫，其食性杂，可为害水稻、玉米、蔬菜、果树、棉花、烟草等109科389种植物，且成虫繁殖力强、幼虫暴食性、抗药性强，极易在短时间内暴发成灾。在过去几十年里，化学防治一直是农作物生产过程中防治斜纹夜蛾最主要的方法。然而，化学农药的不合理使用对环境、生态和人类健康的负面影响也日益突出。生物防治技术逐渐成为社会关注的焦点。生物农药是以自然界生物活体或其代谢产物为有效成分的有害生物防治产品，具有高效、安全和对环境友好的特点。微生物农药的研发与应用得到广泛关注。其中，金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌是近年来使用较多的3种微生物农药，且对鳞翅目害虫表现出较好的防效。但是，据报道，部分地区斜纹夜蛾对苏云金杆菌也产生了抗性。
2、qrt-pcr等分子生物学技术能探测昆虫体内基因表达水平的细微变化，进一步反应昆虫在微生物胁迫条件下体内免疫系统的响应机制。筛选基因表达水平稳定的内参基因，是进行qrt-pcr基因表达相对定量检测的前提，也是获取准确可靠qrt-pcr检测结果的关键。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾内参基因组合及其筛选方法。本专利技术采用不同微生物农药胁迫斜纹夜蛾，获得候选内参基因，并通过对内参基因的筛选与组合，可获取
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾的内参基因组合，所述内参基因组合为rplp0+act5c、rplp0+rps13、rps13+gapdh或rps13+rplp0。
4、作为优选，所述不同微生物农药胁迫为金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌。
5、本专利技术提供了包含所述内参基因组合的引物组，包括如seq id no.1～seq idno.2所示的检测rplp0的引物对、如seq id no.3～seq id no.4所示的检测act5c的引物对、如seq id no.5～seq id no.6所示的检测rps13的引物对、如seq id no.7～seq idno.8所示的检测gapdh的引物对。
6、本专利技术还提供了一种所述内参基因组合的筛选方法，包括以下步骤：
7、(1)采用不同微生物农药处理斜纹夜蛾幼虫，对斜纹夜蛾幼虫进行转录组测序，筛选出不同处理后6～72h中fpkm值大于100的基因作为候选内参基因；
8、(2)以候选内参基因核酸序列为模板，设计pcr特异性引物；
9、(3)斜纹夜蛾幼虫样品总rna提取、cdna合成，以cdna为模板，扩增候选内参基因片段，确定产物单一性；
10、(4)对扩增的内参基因进行实时荧光定量pcr检测，筛选候选内参基因；
11、(5)对候选内参基因进行稳定性分析；
12、(6)选择各处理稳定性排前两名的基因作为内参基因。
13、作为优选，步骤(1)所述的不同微生物农药处理斜纹夜蛾幼虫的方式为：第一组直接处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾幼虫；第二组间接处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾人工饲料，再用处理过的人工饲料饲养斜纹夜蛾幼虫；第三组综合处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾幼虫，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾人工饲料，再用处理过的人工饲料饲养处理过的斜纹夜蛾幼虫；各组用蒸馏水替代微生物农药进行处理作为对照。
14、作为优选，步骤(2)所述的候选内参基因为rplp0、act5c、rps13、gapdh、ak、ubc、act、tub、uccr，所述的pcr特异性引物序列依次如seq id no.1～18所示。
15、作为优选，步骤(3)所述的斜纹夜蛾幼虫样品总rna提取采用trizol，所述的cdna合成采用primescripttm rtmaster mix。
16、作为优选，步骤(4)所述的筛选候选基因的方法为：根据实时荧光定量pcr检测结果，筛选溶解曲线波峰单一，ct值范围在15至30之间，且稀释模板检测引物扩增效率在90％至110％之间，r2>0.97的候选内参基因。
17、作为优选，步骤(5)所述的稳定性分析的具体方法为采用genorm、normfinder、bestkeeper、reffinder和δct法。
18、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
19、(1)本专利技术首次验证和比较了斜纹夜蛾9个候选内参基因(rplp0、act5c、rps13、gapdh、ak、ubc、act、tub和uccr)分别在金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌农药胁迫下，特别是在各种不同的农药处理方式下的表达量及表达稳定性高低。
20、(2)本专利技术设计的pcr引物具有特异性，引物扩增效率介于91.2％至109.5％，r2介于0.9968至0.9998，为内参基因筛选奠定基础。
21、(3)本专利技术采用qrt-pcr技术首次筛选出不同微生物农药胁迫下，特别是在各种不同的农药处理方式下，斜纹夜蛾体内基因表达量相对稳定的内参基因组合rplp0+act5c、rplp0+rps13、rps13+gapdh或rps13+rplp0。
22、(4)本专利技术筛选出的内参基因组合rplp0+act5c、rplp0+rps13、rps13+gapdh或rps13+rplp0为不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾体内基因表达相对定量研究提供可靠保障。
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1.一种不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾的内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为RPLP0+ACT5C、RPLP0+RPS13、RPS13+GAPDH或RPS13+RPLP0。
2.根据权利要求1所述的内参基因组合，其特征在于，所述不同微生物农药胁迫为金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌。
3.检测权利要求1所述的内参基因组合的引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的检测RPLP0的引物对、如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示的检测ACT5C的引物对、如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示的检测RPS13的引物对、如SEQ ID NO.7～SEQID NO.8所示的检测GAPDH的引物对。
4.如权利要求1所述的内参基因组合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的不同微生物农药处理斜纹夜蛾幼虫的方式为：第一组直接处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾幼虫；第二组间接处理组，
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述的候选内参基因为RPLP0、ACT5C、RPS13、GAPDH、AK、UBC、ACT、TUB、UCCR，所述的PCR特异性引物序列依次如SEQID No.1～18所示。
7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述的斜纹夜蛾幼虫样品总RNA提取采用TRIzol，所述的cDNA合成采用PrimeScriptTM RT Master Mix。
8.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述的筛选候选基因的方法为：根据实时荧光定量PCR检测结果，筛选溶解曲线波峰单一，CT值范围在15至30之间，且稀释模板检测引物扩增效率在90％至110％之间，R2>0.97的候选内参基因。
9.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)所述的稳定性分析的具体方法为采用geNorm、Normfinder、BestKeeper、RefFinder和ΔCT法。
...【技术特征摘要】
1.一种不同微生物农药胁迫下斜纹夜蛾的内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为rplp0+act5c、rplp0+rps13、rps13+gapdh或rps13+rplp0。
2.根据权利要求1所述的内参基因组合，其特征在于，所述不同微生物农药胁迫为金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌。
3.检测权利要求1所述的内参基因组合的引物组，其特征在于，包括如seq id no.1～seq id no.2所示的检测rplp0的引物对、如seq id no.3～seq id no.4所示的检测act5c的引物对、如seq id no.5～seq id no.6所示的检测rps13的引物对、如seq id no.7～seqid no.8所示的检测gapdh的引物对。
4.如权利要求1所述的内参基因组合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的不同微生物农药处理斜纹夜蛾幼虫的方式为：第一组直接处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾幼虫；第二组间接处理组，采用浸渍法分别用金龟子绿僵菌、短稳杆菌和苏云金杆菌处理斜纹夜蛾人工饲料，再用处理过的人工饲料饲养斜纹夜蛾幼虫；第三组综合处理组，采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴霜，陈磊，罗云米，曾志红，余鹰，刘斌，
申请(专利权)人：重庆市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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