【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和转基因，具体涉及一种小麦遗传转化方法。
技术介绍
1、植物遗传转化技术是转基因植物产品研发的核心环节。农杆菌介导法已成为目前植物转基因研究中应用最为广泛的遗传转化技术。
2、小麦是异源六倍体单子叶植物，并不是农杆菌的天然宿主，再加上基因组复杂和外植体再生困难，农杆菌介导的遗传转化一直存在转化效率低的问题。bbm/wus2、grf4/gif1等形态发生基因对提升植物遗传转化效率具有重要作用。中国专利cn 114134173 a中公开了使用bbm/wus2辅助载体可以将小麦遗传转化效率提升到19.0％～39.5％。
3、然而，上述遗传转化方法是以小麦幼胚作为外植体。幼胚需要在特定的时间点(例如授粉后10-15天)采收，且由于幼胚的尺寸太小(约1mm左右)，需要很有经验的熟练技术人员才能从种子中剥出来，这些工序会大大降低遗传转化的工作效率、增加人工和材料种植成本。因此，本领域技术人员一直希望能够使用成熟胚作为外植体进行遗传转化。但是由于农杆菌极难侵染小麦成熟胚，因此本领域一直没有基于成熟胚的高效遗传转化方法。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供一种基于成熟胚的小麦高效遗传转化方法。
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术提供一种农杆菌侵染小麦成熟胚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
4、1)获得表达grf4/gif1、bbm、wus2三个蛋白的农杆菌；
5、2)用1)所述的农杆菌
6、在一些实施方案中，上述步骤1)中农杆菌为表达grf4/gif1与同时表达bbm和wus2的农杆菌，以10:1的比例混合而得。
7、在一些实施方案中，上述的grf4/gif1蛋白序列如seq id no.1所示，所述的bbm蛋白序列如seq id no.2所示，所述的wus2蛋白序列如seq id no.3所示。
8、在一些实施方案中，上述的grf4/gif1蛋白由ubi启动子、grf4/gif1核酸分子、nos终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的bbm蛋白由玉米pltp启动子、玉米bbm基因、tt28终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的wus2蛋白由玉米axig1启动子、玉米wus2基因、tin2-1终止子依次连接而成的表达盒表达。
9、在一些实施方案中，上述的ubi启动子、grf4/gif1核酸分子、nos终止子、玉米pltp启动子、玉米bbm基因、tt28终止子、玉米axig1启动子、玉米wus2基因、tin2-1终止子的序列分别如seq id no.4～seq id no.12所示。上述为本领域技术人员所熟知的启动子、基因和终止子，本领域技术人员可以根据实际需要在效果等同性的基础上调整上述元件的序列。
10、在一些实施方案中，上述的预培养为使用ms培养基在25～28℃环境下培养1～3天。
11、在一些实施方案中，上述的预培养为使用ms培养基在25℃光下培养2天。
12、本专利技术提供一种小麦成熟胚的遗传转化方法，其特征在于，在上述的方法基础上，还包括如下步骤：
13、3)在侵染前将成熟胚进行46℃热激处理和40％强度的超声波处理，其中热激处理时间在30～40分钟间，超声波处理时间为6分钟；
14、4)侵染后的成熟胚经过恢复培养、分化筛选培养和生根培养，直到获得阳性转化植株。
15、在一些实施方案中，上述的热激处理为46℃热激处理40分钟。
16、在一些实施方案中，上述侵染时的成熟胚来自预培养后开始萌动的种子。
17、在一些实施方案中，上述的萌动的种子为开始长根的种子。
18、本专利技术的优点及有益效果如下：本专利技术通过使用形态发生基因，并优化了预培养、热激、超声等操作环节，成功实现了基于成熟胚的小麦高效遗传转化方法。
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1.一种农杆菌侵染小麦成熟胚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的农杆菌为表达GRF4/GIF1与同时表达Bbm和Wus2的农杆菌，以10:1的比例混合而得。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述的GRF4/GIF1蛋白序列如SEQID NO.1所示，所述的Bbm蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，所述的Wus2蛋白序列如SEQ IDNO.3所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的GRF4/GIF1蛋白由UBI启动子、GRF4/GIF1核酸分子、Nos终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的Bbm蛋白由玉米PLTP启动子、玉米Bbm基因、tT28终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的Wus2蛋白由玉米AXIG1启动子、玉米Wus2基因、tIN2-1终止子依次连接而成的表达盒表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的UBI启动子、GRF4/GIF1核酸分子、Nos终止子、玉米PLTP启动子、玉米Bbm基因、tT28终止子、玉米AX
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预培养为使用MS培养基在25～28℃环境下培养1～3天。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的预培养为使用MS培养基在25℃光下培养2天。
8.一种小麦成熟胚的遗传转化方法，其特征在于，在权利要求1-7任一项所述的方法基础上，还包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的热激处理为46℃热激处理40分钟。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述侵染时的成熟胚来自预培养后开始萌动的种子；任选地，所述的萌动的种子为开始长根的种子。
...【技术特征摘要】
1.一种农杆菌侵染小麦成熟胚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的农杆菌为表达grf4/gif1与同时表达bbm和wus2的农杆菌，以10:1的比例混合而得。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述的grf4/gif1蛋白序列如seqid no.1所示，所述的bbm蛋白序列如seq id no.2所示，所述的wus2蛋白序列如seq idno.3所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的grf4/gif1蛋白由ubi启动子、grf4/gif1核酸分子、nos终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的bbm蛋白由玉米pltp启动子、玉米bbm基因、tt28终止子依次连接而成的表达盒表达，所述的wus2蛋白由玉米axig1启动子、玉米wus2基因、tin2-1终止子依次连接而成的表达盒表达。
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：许洁婷，鄢文豪，周子茹，杨雅文，何超，
申请(专利权)人：常州新米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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