【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种分泌表达pd-l1的工程益生菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、人体细胞的生长和增殖离不开充足的氧气及能量供应。在供氧正常的人体组织中，细胞90％的能量由线粒体内的有氧氧化反应提供，其余的10％依赖于葡萄糖酵解。然而在肿瘤组织内，由于大量实体肿瘤的侵略性增殖，导致内部代谢和耗氧速度加快，但其内部不能相应地建立新生的血管网络用于供氧或新生的血管结构与功能异常，这些不规则的血管内部存在着“盲端”且具有较高的渗透性，致使血液成分外渗至组织间隙，加大了血流粘滞阻力。这些因素使氧气的供应量远远不足，从而产生了局部缺氧的肿瘤微环境。许多相关的乏氧环境响应的药物，正是利用肿瘤部位这一特点来提高自身的特异性和靶向性。
2、启动子是在dna链上通过与rna聚合酶结合，从而启动mrna合成的一段序列，是基因表达调控中重要的组件之一。在大肠杆菌和沙门氏菌活载体的研究中，为了稳定细菌在肿瘤病灶的外源蛋白表达水平，已有报道通过挖掘在厌氧培养条件下稳定的天然启动子，或通过改造天然启动子来优化细菌的外源蛋白表达系统。
3、厌氧全局调控因子fnr(ftimarate and nitrate reduction)位于大肠杆菌遗传图谱上29min处。fnr调节许多功能不同的基因，如呼吸酶、跨膜底物载体、参与厌氧分解代谢或发酵的酶以及参与生物合成途径的基因。fnr是一种含有氧响应[4fe-4s]簇的细胞质传感器-调节器，以二聚体形式发挥功能。fnr在以每个子单元中包含一个[4fe-4s]2+簇的同分体存在的形
4、纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scfv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的vhh结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。vhh晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kd，因此也被称作纳米抗体(nanobody，nb)。
5、e.coli nissle 1917是一种兼性厌氧型的非致病性革兰氏阴性菌株，不表达已知的毒力因子，如α-溶血素和p-菌毛粘附素。自发现以来，它普遍用于调节肠道微生物群，缓解炎症和抗菌等。例如，e.coli nissle 1917能在人体肠道定殖，防止病原菌对肠道黏膜的侵袭，对肠道黏膜屏障起到保护和修护作用，在临床上可用于治疗炎症性胃肠功能障碍相关疾病。除此之外，ecn具有良好的厌氧靶向定殖能力，可以选择性地定植于实体瘤内厌氧内核，是一种新兴的药物递送载体。ecn还具有明确的遗传背景，是常用的工程菌之一，通过对ecn进行基因工程改造表达特定的生物药物，可实现药物向肿瘤部位的靶向递送。
6、现有相关技术已有工程菌在表达纳米抗体的应用，如用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体cablivi(cn 115819599 a)公开了一种筛选信号肽来提高纳米抗体产量的技术。如现有技术枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法(cn 111748571a)通过基因工程的方法，对枯草芽孢杆菌进行改造，得到可用于生产纳米抗体的多功能稳定的平台。现有技术并没有着重从转录水平开始提高纳米抗体表达效率，且现有技术中的改造菌大多属于致病菌的大肠杆菌，益生菌是否可以并如何进入体内进行高效表达纳米抗体直击肿瘤病灶，是需要急需解决的技术问题。
技术实现思路
1、专利技术目的：为了针对现有技术中细菌在体内分泌的治疗蛋白可能在正常组织中过表达引起不良反应、在肿瘤病灶部位低表达导致的药效不足难题，本专利技术提供一种响应肿瘤部位低氧环境特异分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，避免了pd-l1纳米抗体在正常组织中的泄露表达，提高其在肿瘤组织中的表达量，从而增强pd-l1纳米抗体的抗肿瘤疗效。
2、本专利技术还提供所述分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌的构建方法和应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提供了一种分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，所述工程益生菌包括益生菌出发菌株和分泌表达pd-l1纳米抗体的重组表达载体，所述益生菌出发菌株选自大肠杆菌，所述分泌表达pd-l1纳米抗体的重组表达载体包括厌氧启动子、pd-l1纳米抗体编码基因和ptrc99a表达载体。
4、其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌nissle 1917。
5、其中，所述厌氧启动子选自fnrs启动子、nirb启动子、aspa启动子、cyda启动子、foca启动子、frda启动子、narg启动子、vgb启动子、svgb启动子中的至少一种，其序列分别如seq id no.1-9所示。
6、优选地，所述厌氧启动子为fnrs启动子。
7、其中，所述pd-l1纳米抗体编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示，pd-l1纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.11所示。
8、本专利技术所述的分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌的构建方法，包括如下步骤：
9、以ptrc99a为表达载体为基础，替换原有载体上启动子为fnrs启动子、nirb启动子、aspa启动子、cyda启动子、foca启动子、frda启动子、narg启动子、vgb启动子、svgb启动子中的一种，导入编码pd-l1纳米抗体的目标基因构建重组表达载体，将重组表达载体转化至大肠杆菌，获得所述工程益生菌。
10、进一步地，所述工程益生菌在37℃，220rpm的温度条件下培养，随后在厌氧环境中37℃，220rpm的温度条件下诱导表达pd-l1纳米抗体。
11、进一步地，所述培养包括配置包含10.0g/l蛋白胨，5.0g/l酵母粉，10.0g/lnacl，ph 7.0的lb培养基，将含有lb培养基的锥形瓶用含透气滤膜的封口膜封住，提前置于含有10％氢气+10％二氧化碳+80％氮气的厌氧箱12h以上以便于置换掉原有lb培养基内的氧气。将活化后的菌液按1％的体积比例接种至含有6ml lb培养基的摇菌管中(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，于37℃、220rpm条件下培养至od600＝0.6-1.2。取1.5ml菌液离心收集菌体，菌体利用提前配置好的去氧lb培养基重悬，重悬菌液至od600＝0.6-1.2(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，于37℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌包括益生菌出发菌株和分泌表达PD-L1纳米抗体的重组表达载体，所述益生菌出发菌株选自大肠杆菌，所述分泌表达PD-L1纳米抗体的重组表达载体包括厌氧启动子、PD-L1纳米抗体编码基因和pTrc99a表达载体。
2.根据权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌Nissle 1917。
3.根据权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧启动子选自fnrS启动子、nirB启动子、aspA启动子、cydA启动子、focA启动子、frdA启动子、narG启动子、VGB启动子、sVGB启动子中的至少一种，其序列分别如SEQ ID NO.1-9所示。
4.根据权利要求3所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧启动子优选为fnrS启动子。
5.根据权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述PD-L1纳米抗体编码基因的核苷酸序列如SEQ
6.一种权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.一种权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌在增强体内递送PD-L1纳米抗体的应用。
8.一种权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌在改善PD-L1纳米抗体的表达中的应用。
9.根据权利要求7或者8所述的应用，其特征在于，所述工程益生菌能够提高在肿瘤低氧部位的PD-L1表达量，降低在正常有氧组织的PD-L1表达量。
10.一种权利要求1所述的分泌表达PD-L1纳米抗体的工程益生菌在制备治疗肿瘤的生物试剂方面中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌包括益生菌出发菌株和分泌表达pd-l1纳米抗体的重组表达载体，所述益生菌出发菌株选自大肠杆菌，所述分泌表达pd-l1纳米抗体的重组表达载体包括厌氧启动子、pd-l1纳米抗体编码基因和ptrc99a表达载体。
2.根据权利要求1所述的分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌nissle 1917。
3.根据权利要求1所述的分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧启动子选自fnrs启动子、nirb启动子、aspa启动子、cyda启动子、foca启动子、frda启动子、narg启动子、vgb启动子、svgb启动子中的至少一种，其序列分别如seq id no.1-9所示。
4.根据权利要求3所述的分泌表达pd-l1纳米抗体的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧启动子优选为fnrs启动...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚楠，马浩铭，梁丽珍，刘维明，周丽，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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