【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于噬菌体展示肽库，具体涉及一种己烯雌酚模拟表位肽及其制备方法和应用。
技术介绍
1、己烯雌酚是一种人工合成的非甾体雌激素，可促进动物生长，被广泛用于畜牧养殖和渔业，但其较低浓度就能显著影响人体生殖系统的发育，产生致畸、致癌等副作用。因此，大多数国家全面禁止使用己烯雌酚作为添加剂。我国农业农村部235公告指出己烯雌酚在动物食品中不得检出。但目前滥用己烯雌酚的现象依然存在，对食用农产品中己烯雌酚残留进行及时高效灵敏的检测是控制其危害和保障食品安全的重要手段。
2、目前，己烯雌酚的检测方法主要是气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、酶联免疫吸附法等。色谱类检测法灵敏度高，但设备昂贵，样品前处理繁琐，难以用于大规模筛查。免疫学检测法虽简单方便、灵敏度高、成本较低，但实施过程中必须使用己烯雌酚标准品为原料进行人工抗原化学合成，己烯雌酚不仅致畸致癌性强且价格昂贵，对操作人员的身体健康及生态环境造成极大的伤害。近年来，研究者们利用噬菌体展示随机肽库技术淘选专一性强、特异性高的模拟表位成功替代小分子抗原进行免疫学检测。但由于这些抗原模拟表位的获取来源于随机天然肽库，受天然肽库库容及多样性的限制，会存在特定靶标抗原模拟表位肽信息的大量缺失，导致淘选出的抗原表位肽替代小分子抗原进行免疫学检测的检测性能不佳。因此，十分有必要淘选到检测性能更优异的己烯雌酚模拟表位肽，从而在建立己烯雌酚的免疫检测方法中不仅能避免使用己烯雌酚标准品、降低检测成本，而且能提高己烯雌酚免疫学方法的检测灵敏度，保障动物源性食品安
技术实现思路
1、本专利技术的目的是解决现有技术的不足，提供一种己烯雌酚模拟表位肽及其制备方法和应用，具体采用以下的技术方案：
2、本专利技术的第一方面，提供了一种己烯雌酚的抗原模拟表位肽，其氨基酸序列为yvypqmp。
3、本专利技术的第二方面，提供了一种编码上述的抗原模拟表位肽的基因，其核苷酸序列为：aggcatctgaggatacacata。
4、本专利技术的第三方面，还提供了一种上述抗原模拟表位肽的制备方法，包括以下步骤：
5、将具有己烯雌酚抗原模拟表位的噬菌体加入至处于对数前期的大肠杆菌er2738培养液中，振动培养4.5 h，培养结束后离心10 min，取上清液并加入peg/nacl，在温度为4℃下静置过夜，然后再进行离心，取沉淀物重悬于tbs中，再一次离心5 min使残余细胞沉淀，得到上层清液，加入peg/nacl，冰上孵育60 min，离心10 min，弃上清，最后将沉淀物重悬于tbs、0.02%nan3中。
6、上述抗原模拟表位肽的制备方法，具体包括以下步骤：
7、（1）将具有己烯雌酚模拟表位的噬菌体加入至20 ml处于对数前期的大肠杆菌er2738培养液中，37 ℃ 150 rpm振动培养4.5 h；
8、（2）将培养物转入另一离心管中，4 ℃ 7000 g离心10 min，将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的peg/nacl，4 ℃静置过夜；
9、（3）4 ℃ 7000 g离心15 min，倒掉上清液，沉淀物重悬于1 ml tbs中，4 ℃ 7000g离心5 min使残余细胞沉淀。
10、（4）上清转入另一新鲜离心管，加入1/6体积peg/nacl，冰上孵育60 min。4 ℃7000 g离心10 min，弃上清，沉淀物重悬于200 µl tbs、0.02%nan3中。
11、在本专利技术中，由于这些抗原模拟表位的获取来源于随机天然肽库，受天然肽库库容及多样性的限制，会存在特定靶标抗原模拟表位肽信息的大量缺失。因此，专利技术人靶向构建了噬菌体展示己烯雌酚模拟表位肽库，并从中淘选出检测性能更优的己烯雌酚模拟表位，该方法不仅能避免使用己烯雌酚标准品、降低检测成本，而且能提高己烯雌酚免疫学方法的检测灵敏度，保障动物源性食品安全。
12、作为进一步优选的实施方式，具有己烯雌酚抗原模拟表位的噬菌体由以下过程得到：
13、（1）将抗己烯雌酚单克隆抗体溶于1×pbs中，在4 ℃包被过夜；去除液体后，用tbst洗涤3次，加入1%ova封闭液，4 ℃封闭反应2 h；
14、（2）反应结束后去除液体，加入tbst洗涤3次，然后加入噬菌体展示己烯雌酚模拟表位肽库，在16 ℃-22 ℃下轻轻振荡反应1 h，弃液体，用tbst清洗10次，除去未结合的噬菌体；
15、（3）加入洗脱液，轻微振荡8 min，取出洗脱液并加入中和缓冲液，即得到第一轮洗脱噬菌体，把得到的第一轮洗脱噬菌体进行扩增和纯化；
16、（4）按照第一轮的步骤依次进行第二轮和第三轮竞争亲和淘选；最终得到具有己烯雌酚抗原模拟表位的噬菌体；
17、其中，在步骤（3）第一轮采用酸洗脱的方式，洗脱液为ph=2.2，浓度为0.2 m的glycine-hcl；
18、在步骤（4）中第二轮和第三轮竞争亲和淘选时采用竞争洗脱的方式，洗脱液为浓度为1 ng/ml的己烯雌酚标准品，且每次加入的上一轮扩增和纯化后的噬菌体量均为1×1010pfu；第二和第三轮竞争亲和淘选的抗体包被浓度分别为5 µg/ml和1 µg/ml，封闭液依次为1%bsa和1%ova；噬菌体和己烯雌酚标准品洗脱的时间分别为45 min和30 min。
19、作为进一步优选的实施方式，噬菌体展示己烯雌酚模拟表位肽库的构建方法，包括以下步骤：
20、s1：先获取己烯雌酚的核心模拟表位，采用基因重组技术靶向构建噬菌体展示己烯雌酚模拟表位肽库，并采用6编码方式，设计合成随机七肽核苷酸，延伸引物和测序引物；
21、s2：将随机七肽核苷酸和3倍摩尔数的延伸引物置于pcr仪中，形成退火产物并进一步延伸形成延伸产物；利用kpni-hf酶和eagi-hf酶对形成的延伸产物及m13ke载体分别进行双酶切，延伸产物双酶切后经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后切胶回收dna条带，加入洗脱液，37 ℃过夜振荡，洗脱dna；次日用酚氯仿法回收随机七肽核苷酸双链的双酶切产物，得到插入序列；m13ke载体的双酶切后经琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，即得到双酶切m13ke产物；
22、s3：将双酶切m13ke产物与插入序列按1：10的摩尔比进行过夜连接，采用酚氯仿法纯化连接产物，用无菌te缓冲液溶解沉淀；连接产物分次进行电转至er2738感受态细胞中，加入soc培养液，振荡培养后即为电转化培养物；将电转化培养物按1：50的比例扩大培养，加入至处于对数生长早期的er2738菌液中，振荡孵育4.5 h，培育结束后离心20 min；将上清液转移并丢弃细胞，加入1/6体积peg/nacl，4 ℃孵育过夜，孵育结束后离心20 min，弃上清液，将噬菌体沉淀完全重悬于tbs中，4 ℃轻轻摇动过夜；然后离心10 min取上清液加1/6体积peg/nacl沉淀噬菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种己烯雌酚的抗原模拟表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为YVYPQMP。
2.一种编码权利要求1所述的抗原模拟表位肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列为：AGGCATCTGAGGATACACATA。
3.一种权利要求1所述的抗原模拟表位肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具有己烯雌酚抗原模拟表位的噬菌体由以下过程得到：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，噬菌体展示己烯雌酚模拟表位肽库的构建方法，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，七肽核苷酸，延伸引物和测序引物的序列分别如下：
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，TBST包括以下组分：
8.权利要求1所述的抗原模拟表位肽在免疫学检测分析中的应用。
9.权利要求1所述的抗原模拟表位肽在作为酶联免疫吸附法的竞争抗原用于检测食品中己烯雌酚的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，食品包括鸡、鱼、虾肉。
【技术特征摘要】
1.一种己烯雌酚的抗原模拟表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为yvypqmp。
2.一种编码权利要求1所述的抗原模拟表位肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列为：aggcatctgaggatacacata。
3.一种权利要求1所述的抗原模拟表位肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具有己烯雌酚抗原模拟表位的噬菌体由以下过程得到：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，噬菌体展示己烯雌酚...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓省亮，苏柳，贺伟华，刘聪，李平，章钢刚，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所江西省流域生态研究所，
类型：发明
国别省市：
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