【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检验领域，具体涉及一种以金属多酚网络荧光微球mpnfm为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
1、荧光免疫层析方法是将荧光纳米材料与免疫层析技术相结合的新型快速检测方法，被广泛应用于医疗诊断、毒品检测、食品安全、环境监控等领域。荧光纳米材料的生物相容性是影响荧光免疫层析方法灵敏度的关键。目前荧光微球的制备方法主要包括微乳液法、溶胀法等，但这些合成方法制备的荧光微球的生物相容性仍不尽人意，无法实现高效的抗体偶联。
2、为了提高荧光微球的生物相容性，通常要对荧光微球进行表面功能化修饰，例如修饰羧基基团，便于用edc法共价结合偶联抗体，或者是增加中间体，例如聚合物链或细胞表面蛋白（protein g），以便于实现抗体的定向偶连；然而，这种化学偶联的过程可能会导致抗体降低活性甚至失去与抗原结合的能力，且封闭时蛋白质冠的吸附可能会覆盖化学偶联的抗体靶向识别位点。
3、与广泛应用的化学偶联相比，抗体通过静电作用能够实现稳定和强大的覆盖，是一种更容易、更灵活和更高效的探针靶向过程。所以有研究通过在荧光微球表面增加具有强粘附性的包覆层，例如聚多巴胺，以便于直接通过静电吸附偶联抗体，但该方法额外的预处理操作繁琐复杂，稳定性不好，且对荧光有淬灭，灵敏度差。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提出一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用，以解决传统方法制得的荧光微球生物相容性差的问题，有效提高免疫层析检测灵敏
2、根据本专利技术提出的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次搭接在底板上的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
3、其中，所述玻璃纤维垫上喷涂有mpnfm标记待测物抗体制备的探针，所述硝酸纤维素膜上依次设置喷涂有待测物人工偶联抗原或者抗体的检测t线和喷涂有抗鼠抗体或抗兔抗体的质控c线。
4、进一步地，所述mpnfm通过将金属离子与多酚水溶液混合配位后，加入至溶解在有机溶剂的荧光染料溶液中搅拌反应，再加入tris缓冲溶液将ph调至8-10后，将混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两边后复溶得到。
5、进一步地，所述探针通过向所述mpnfm中分别加入待测物抗体，混匀后室温反应0.4-0.6 h，加入封闭剂，室温反应0.8-1.2 h，离心取沉淀，复溶后得到。
6、进一步地，所述金属离子为fe（iii），fe（ii），co（ii），ni（ii），cu（ii），zn（iiii），zr（ii），mg（ii），mn （ii），ca（ii）中的一种。
7、进一步地，所述多酚为单宁酸、没食子酸、花青素、表儿茶素中的一种。
8、进一步地，所述有机溶剂为四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、吡啶、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、丙酮中的一种。
9、进一步地，加入所述待测物抗体后的所述待测物抗体终浓度为1-5 μg/ml，加入所述封闭剂后的所述封闭剂的终浓度为1-20%，所述封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的任意一种。
10、进一步地，所述离心时转速为10000-15000 r/min，时间为15-30 min，离心后得到的沉淀采用0.01 m、ph=7.4的磷酸盐缓冲液进行复溶。
11、根据本专利技术第二方面，还提供一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条的制备方法，用于制备上述的免疫层析试纸条，所述制备方法包括：
12、s01、硝酸纤维素膜的制备：
13、（1）使用0.01 m、ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液分别调节待测物人工偶联抗原和二抗（抗鼠源抗体或抗兔源抗体）至浓度为0.01-1.0 mg/ml；
14、（2）将调整浓度后的不同待测物人工偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上部作为检测线，将抗鼠源抗体或抗兔源抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷膜量均为0.3-0.8 μl/cm；
15、（3）将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃干燥4 h后，在室温干燥箱保存备用。
16、s02、mpnfm抗体探针玻璃纤维垫的制备；
17、s03、组装试纸条；
18、s04、裁切、装袋、干燥、封口保存。
19、根据本专利技术第三方面，还提供上述免疫层析试纸条在免疫层析检测中的应用。
20、综上，根据本专利技术提出的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条及其制备方法和应用，具有以下优点：
21、（1）由于荧光染料开始分散溶解于有机溶剂中，在加入水相后由于疏水作用自聚成核，金属离子与多酚在水相中配位形成3d交联的金属多酚网络，在形成的荧光染料纳米聚集体表面沉积，从而形成核壳型mpnfm；mpnfm表面的金属多酚网络具有很强的吸附作用和优异的生物相容性，显著提高了其抗体偶联效率。
22、（2）本专利技术制备的以mpnfm为标记物的免疫层析方法首次以mpnfm作标记物，相比于传统方法制备的荧光微球，mpnfm具有更高的抗体偶联效率，可提高其检测灵敏度，且生物相容性好，制备得到的以mpnfm为标记物的免疫层析方法稳定性强。目前，尚未有以mpnfm为标记物建立免疫层析方法的相关报道。
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1.一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次搭接在底板上的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
2.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述MPNFM通过将金属离子与多酚水溶液混合配位后，加入至溶解在有机溶剂的荧光染料溶液中搅拌反应，再加入Tris缓冲溶液将pH调至8-10后，将混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两边后复溶得到。
3.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述探针通过向所述MPNFM中分别加入待测物抗体，混匀后室温反应0.4-0.6h，加入封闭剂，室温反应0.8-1.2 h，离心取沉淀，复溶后得到。
4.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金属离子为Fe（III），Fe（II），Co（II），Ni（II），Cu（II），Zn（IIII），Zr（II），Mg（II），Mn （II），Ca（II）中的一种。
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6.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、丙酮中的一种。
7.根据权利要求3所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，加入所述待测物抗体后的所述待测物抗体终浓度为1-5 μg/mL，加入所述封闭剂后的所述封闭剂的终浓度为1-20%，所述封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的任意一种。
8.根据权利要求3所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述离心时转速为10000-15000 r/min，时间为15-30 min，离心后得到的沉淀采用0.01 M、pH=7.4的磷酸盐缓冲液进行复溶。
9.一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条的制备方法，用于制备权利要求1-8任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述制备方法包括：
10.根据权利要求1-8任一项所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条在免疫层析检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括底板，以及依次搭接在底板上的样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
2.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述mpnfm通过将金属离子与多酚水溶液混合配位后，加入至溶解在有机溶剂的荧光染料溶液中搅拌反应，再加入tris缓冲溶液将ph调至8-10后，将混合液离心弃上清，沉淀物用超纯水清洗两边后复溶得到。
3.根据权利要求1所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述探针通过向所述mpnfm中分别加入待测物抗体，混匀后室温反应0.4-0.6h，加入封闭剂，室温反应0.8-1.2 h，离心取沉淀，复溶后得到。
4.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金属离子为fe（iii），fe（ii），co（ii），ni（ii），cu（ii），zn（iiii），zr（ii），mg（ii），mn （ii），ca（ii）中的一种。
5.根据权利要求2所述的一种以金属多酚网络荧光微球为标记物的免疫层析试纸条，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓省亮，赖晓翠，赖卫华，章钢刚，刘聪，苏柳，贺伟华，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所江西省流域生态研究所，
类型：发明
国别省市：
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