【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学分析与检测，具体涉及一种可快速识别和检测半胱氨酸的荧光增强型分子探针以及该探针在动物成像检测、植物成像检测以及sds-page(sds聚丙烯酰胺凝胶电泳技术)的蛋白质染色中的应用。
技术介绍
1、半胱氨酸(cys)是一种小分子生物硫醇，参与多种生理过程，在植物生长中起着至关重要的作用。半胱氨酸是合成硫代谢产物的重要前体，同时还具有大量的抗氧化活性，可以保护植物体免受自由基和其他有害化合物的侵害。然而，由于cys的强还原性，其浓度过大容易引起植物氧化损伤，导致细胞毒性。
2、目前，半胱氨酸的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法、紫外分光光度法和荧光探针分析法等。其中，荧光探针分析法因其操作简单、灵敏度高、检测限低、响应快、抗干扰能力强以及可在活细胞、组织或生物体中直接检测等优点而受到广泛关注。而且，检测半胱氨酸的荧光探针需要具有选择性以排除其他硫醇对检测的干扰。因此，设计和开发能选择性响应半胱氨酸并且能够在生物体中检测半胱氨酸的荧光探针具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提供一种能快速、选择性响应半胱氨酸的荧光增强型探针，为半胱氨酸的特异性检测提供新的工具。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种选择性识别半胱氨酸的双光子荧光探针，所述双光子荧光探针的分子式为c23h19n3o2，且其结构式如式(i)所示：
4、
5、
6、
7、本专利技术第二方面提供了一种制备本专利技术所述双光子荧光探针的方法，包括以下步骤：
8、s1、将异氟尔酮(1,1,3-三甲基环己烯酮)和丙二腈溶于有机溶剂中，加入哌啶和醋酸，反应后生成中间体a；
9、s2、将中间体a溶于有机溶剂中，加入4-乙酰氨基苯甲醛，反应后生成中间体b；
10、s3、将中间体b溶于有机溶剂中，加入浓盐酸，反应后得到中间体c；
11、s4、将中间体c和马来酸酐溶于有机溶剂中，反应后得到双光子荧光探针；
12、其中，所述中间体a、中间体b和中间体c的结构式如下所示：
13、
14、优选地，在本专利技术方法中，步骤s1具体为：将1摩尔当量的异氟尔酮和1～5摩尔当量的丙二腈溶于无水乙醇中，加入哌啶和醋酸，高温反应20～30小时，分离纯化得到中间体a。
15、更为优选地，步骤s1所述分离纯化的操作为：待反应结束后，蒸发去除溶剂，将得到的出产物经过硅胶柱色谱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂。
16、优选地，在本专利技术方法中，步骤s2具体为：将1摩尔当量的中间体a和1～3摩尔当量的4-乙酰氨基苯甲醛溶解在乙腈中，加入哌啶，高温反应，反应液经过分离纯化得到中间体b。
17、更为优选地，步骤s2所述分离纯化的操作为：待反应结束后，反应液经减压蒸馏、纯化得到中间体b，或将反应液冷却析出固体，抽滤并用无水乙醇洗涤后得到中间体b，所述中间体b为橙色固体。
18、优选地，在本专利技术方法中，步骤s3具体为：将中间体b在浓盐酸和乙醇的混合溶液中高温反应10～20小时，反应结束后将反应液分离纯化，得到中间体c。
19、更为优选地，步骤s2所述分离纯化的操作为：待反应完毕后，将反应液调ph至中性或弱碱性，用乙酸乙酯萃取并干燥，再将所得粗产物经硅胶柱色谱纯化，使用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，得到中间体c；所述中间体c为红黑色固体。
20、优选地，在本专利技术方法中，步骤s4具体为：将1摩尔当量的中间体c和1～3摩尔当量的马来酸酐加入到乙酸中反应5～10小时，反应结束后蒸干溶剂；再加入1～3摩尔当量的乙酸钠，并在乙酸酐中高温反应数小时，经分离纯化制得双光子荧光探针。
21、本专利技术第三方面提供了本专利技术所述的双光子荧光探针在半胱氨酸定性和/或定量检测中的应用。本专利技术的实验数据表明：本专利技术的双光子荧光探针的背景低，对半胱氨酸具有高选择性且响应速度快、强度高，而且在一定浓度范围内，包含荧光探针、半胱氨酸的反应体系在580nm处的荧光强度随半胱氨酸的浓度增加而增加，可见本专利技术所述的双光子荧光探针能够实现半胱氨酸定性和定量检测。
22、鉴于本专利技术所述的双光子荧光探针能够用于检测植物和动物样品中的半胱氨酸，本专利技术第四方面提供了该双光子荧光探针在目视定性检测和/或成像检测植物和动物中的应用。其中，所述植物包括但不限于拟南芥，所述动物包括但不限于斑马鱼。
23、本专利技术第五方面提供了本专利技术所述的双光子荧光探针在sds-page的蛋白质染色中的应用，即本专利技术所述的双光子荧光探针能够作为sds-page中蛋白质的染色剂，相对于传统的考马斯亮蓝染色剂，该双光子荧光探针具有操作简单，染色时间短，无需脱色，灵敏度高等特点。
24、相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术为半胱氨酸的特异性检测提供了一个新型荧光探针，该探针结构新颖、合成简单、响应速度快，而且斯托克斯位移大(180nm)，对半胱氨酸的选择性好；本专利技术提供的荧光探针不仅能够实现对水环境和生物样品(包括植物和动物)中的半胱氨酸检测，而且还可以在sds-page中作为一种新型蛋白质荧光染色剂。
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1.一种选择性识别半胱氨酸的双光子荧光探针，其特征在于，所述双光子荧光探针的分子式为C23H19N3O2，且其结构式如下所示：
2.一种制备如权利要求1所述双光子荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：将1摩尔当量的异氟尔酮和1～5摩尔当量的丙二腈溶于无水乙醇中，加入哌啶和醋酸，60～100℃反应20～30小时，分离纯化得到中间体a。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：将1摩尔当量的中间体a和1～3摩尔当量的4-乙酰氨基苯甲醛溶解在乙腈中，加入哌啶，60～100℃反应，反应液经过分离纯化得到中间体b。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3具体为：将中间体b在浓盐酸和乙醇的混合溶液中60～100℃反应10～20小时，反应结束后将反应液分离纯化，得到中间体c。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S4具体为：将1摩尔当量的中间体c和1～3摩尔当量的马来酸酐加入到乙酸中反应1～5小时，反应结束后蒸干溶剂；再加入1～3摩
7.如权利要求1所述双光子荧光探针的应用，其特征在于，至少为以下任一种：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述双光子荧光探针与半胱氨酸响应后生成分子式为C26H26N4O4S的产物，所述产物在580nm处有最大发射波长且具有黄色荧光，所述产物的结构式如下所示：
...【技术特征摘要】
1.一种选择性识别半胱氨酸的双光子荧光探针，其特征在于，所述双光子荧光探针的分子式为c23h19n3o2，且其结构式如下所示：
2.一种制备如权利要求1所述双光子荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s1具体为：将1摩尔当量的异氟尔酮和1～5摩尔当量的丙二腈溶于无水乙醇中，加入哌啶和醋酸，60～100℃反应20～30小时，分离纯化得到中间体a。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s2具体为：将1摩尔当量的中间体a和1～3摩尔当量的4-乙酰氨基苯甲醛溶解在乙腈中，加入哌啶，60～100℃反应，反应液经过分离纯化得到中间体b。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤...
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