【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，具体地，涉及一种人原代胶质母细胞瘤获得性耐药细胞系及其应用。
技术介绍
1、胶质瘤是发生在中枢神经系统(central nervous systems，cns)最常见的恶性脑肿瘤之一。胶质瘤的常规治疗包括手术切除，放疗和以替莫唑胺为基础的化疗，亚硝基脲类烷化剂和血管内皮生长因子抑制剂为二线药物。随着影像学技术的不断提升，高度恶性胶质瘤的检出率不断升高。由于胶质瘤具有高增殖潜力和浸润性生长的特点，很难进行完整的切除，并且放疗和化疗对生活质量有很大的负面影响，因此患者通常预后不佳，几乎100％复发。组织学分四级：i级、ii级呈低恶性度，具有良性生物学特性；iii级和iv级为高级别胶质瘤。其中最常见的胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)5年生存率小于5％，其中位生存期仅为12-18个月，间变胶质瘤(who iii级)的中位生存期为2-5年，低级别胶质瘤(whoi、ii级)的中位生存期也仅为4-10年。
2、近年来，针对各种分子靶点开展的恶性肿瘤药物取得了巨大进展，给脑恶性胶质瘤的治疗带来了曙光。v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物b(braf)基因激活突变出现在15％患有胶质母细胞瘤的年轻人中，其位于7号染色体长臂的34位。错义突变和异常融合是braf改变的最常见原因。在错义突变中，最常见的仍然是在600位用缬氨酸替代谷氨酸(v600e)，而在异常融合中，主导蛋白质n末端部分的畸变。此外，基于新提出的分类，braf突变可分为三类：1类(激酶激活，密码子600包括v600e、v600m、v60
3、目前，大多数癌症细胞模型已经使用了几十年，永生化的细胞系经过数千代培养，其细胞基因组成和生物学行为均发生改变。已广泛用于神经肿瘤学研究的细胞系包括ln-229、u-87mg、u-251等均来源于白种人，几乎没有具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤细胞系，且明确分子分型的细胞系更少。另外，主要存在的问题是存在原发性耐药或发生获得性耐药，严重限制了其临床应用。因此，获取更多的实验材料进行潜在新机制的研究显得至关重要。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种人原代胶质母细胞瘤获得性耐药细胞系及其应用。
2、本专利技术的专利技术人利用患者来源的braf v600e突变的胶质瘤组织原代培养获得的稳定多次传代的人脑胶质瘤细胞系进行达拉非尼耐药诱导，诱导获得的braf v600e突变的人脑胶质瘤细胞系对胶质瘤靶向药物(达拉非尼)耐药，是研究胶质瘤耐药机制的良好试验材料，能够作为达拉非尼耐药新机制探索研究的理想材料，具有很高的科研价值和开发意义。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
4、本专利技术的第一方面提供了一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系。
5、进一步，所述获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.45631，保藏日期为2023年07月25日。
6、在本专利技术中，所述获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系即为本专利技术实施例中构建得到的人脑胶质瘤获得性耐药细胞系glioma-zzg01-dara。本专利技术进一步通过对比实验验证发现本专利技术构建得到的glioma-zzg01-dara的细胞活力显著优于商品化的胶质瘤细胞系u87，倍增时间显著更短，具有显著更优的细胞性能，为本领域关于达拉非尼耐药新机制的探索研究提供了理想的细胞系模型。
7、本专利技术的第二方面提供了一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系。
8、进一步，所述子代细胞系由本专利技术第一方面所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系传代得到。
9、本专利技术的第三方面提供了一种本专利技术第一方面所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的构建方法。
10、进一步，所述方法包括如下步骤：
11、(1)将原代培养的人脑胶质瘤细胞接种于含达拉非尼的培养液中进行培养；
12、(2)对耐药诱导成功的肿瘤细胞进行传代培养得到本专利技术第一方面所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系。
13、进一步，传代培养的培养基为含5％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％ b27、0.5％n2、10μg/ml insulin、10ng/ml bfgf、10ng/ml egf、10ng/ml pdgf-ab、0.08μm达拉非尼的dmem/f12培养液。
14、在本专利技术中，原代培养是通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
15、在本专利技术中，传代培养是指原代培养形成单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。可以理解，在任何时候，细胞从一个培养瓶接种到另一个培养瓶时总会丢失一部分，因此，在客观上细胞必定有所稀释。
16、在一些实施方案中，所述原代培养为贴壁培养或酶消化法培养。具体而言，酶消化法包括如下步骤：加入消化酶使得组织溶解而释放细胞。所述酶消化法培养均为本领域技术人员公知的常规操作。
17、在一些实施方案中，所述传代培养包括弃去进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入新鲜的胰蛋白酶细胞消化液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的完全培养基震荡或拍打使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心重悬接种于新的培养瓶继续培养；每次待细胞长满整个培养瓶或长至80％以上时则分瓶进行传代培养，每瓶细胞在进行传代培养时将该代肿瘤细胞分成2-5瓶，在这些新的培养瓶中继续培养其子代肿瘤细胞。
18、本专利技术的第四方面提供了一种获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型。
19、进一步，所述获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型是通过将本专利技术第一方面所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系或本专利技术第二方面所述的子代细胞系接种于非人哺乳动物体内形成的。
20、在一些实施方案中，所述非人哺乳动物包括但不限于：猫、犬、啮齿动物。其中，啮齿动物包括但不限于：大鼠、小鼠、家兔、仓鼠、豚鼠。
2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系，其特征在于，所述获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.45631，保藏日期为2023年07月25日。
2.一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系，其特征在于，所述子代细胞系由权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系传代得到。
3.一种权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，传代培养的培养基为含5％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％B27、0.5％N2、10μg/mLinsulin、10ng/mL bFGF、10ng/mL EGF、10ng/mLPDGF-AB、0.08μM达拉非尼的DMEM/F12培养液。
5.一种获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型，其特征在于，所述获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型是通过将权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系接种于非人哺乳动物体内形成的。
6.一种权利要求
7.一种体外筛选用于治疗达拉非尼耐药的胶质瘤的药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在制备获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型中的应用。
9.权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在筛选用于治疗达拉非尼耐药的胶质瘤的药物中的应用。
10.权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系或权利要求2所述的子代细胞系在开发达拉非尼耐药的胶质瘤的药物靶点或在研究胶质瘤耐药机制中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系，其特征在于，所述获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.45631，保藏日期为2023年07月25日。
2.一种获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系，其特征在于，所述子代细胞系由权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系传代得到。
3.一种权利要求1所述的获得性耐药的人脑胶质瘤细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，传代培养的培养基为含5％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％b27、0.5％n2、10μg/mlinsulin、10ng/ml bfgf、10ng/ml egf、10ng/mlpdgf-ab、0.08μm达拉非尼的dmem/f12培养液。
5.一种获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型，其特征在于，所述获得性耐药的人脑胶质瘤动物模型是通过将权利要求1所述的获得性耐...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜睿琦，曹明楠，赵志刚，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京天坛医院，
类型：发明
国别省市：
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