【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学和生物，尤其涉及用于糖尿病慢性肾功能损伤检测的基因生物标志物及试剂盒。
技术介绍
1、糖尿病，特别是ii型糖尿病(t2dm)并发高血压很容易引起慢性肾功能损伤。
2、由于肾脏的巨大代偿功能，早期阶段的慢性肾功能损伤是隐匿性的，病人没有明显的不适感觉，常规临床检测也无异常表现，只有发展到超过50％的肾功能丧失，才会出现临床症状和常规实验室检测异常。当肾小球滤过率(egfr)<30ml/min-1/1.73m-2肾功能损伤是不可逆的。随着ii型糖尿病(t2dm)患病率的增加，如何早期发现慢性肾损伤，采取措施治疗或延缓病情的发展，对广大群体的糖尿病病人和其他原因造成的慢性肾损伤病人的健康，是极为需要的。
3、目前对糖尿病肾病(dkd)的诊断及筛查通常是基于尿白蛋白肌酐比和/或肾小球过滤率(egfr)，且没有其他肾脏损害的迹象或征兆而做出的临床诊断。由于尿液成分(尤其是蛋白质)检测的标准化工作尚未完成，故不同检测系统间检测结果可能存在差异，可能会出现假阴性或假阳性的测定结果。肾小球滤过率操作繁琐，并且只提供一个估算的结果。总之，目前dkd的临床诊断缺乏特异性的标准和指标。
4、研究发现，早期隐匿性的dkd肾功能损伤主要表现在肾脏的肾小球和肾小管，尽早开始药物等干预，可以延缓出现器质性肾脏病变。慢性肾损伤标志物的检测有助于及时发现早期肾小球、肾小管和肾间质病变，同时对监测dkd的病情进展、判断肾脏损伤的程度和预后以及判断治疗干预效果等具有重要的临床价值。研究显示，早期诊断dkd可
5、然而，目前还没有成熟的通过早期发现和及时治疗来预防慢性肾功能损伤的方法以及对应的基因生物标志物。
6、本专利技术是通过检测尿液脱离细胞中与慢性肾功能损伤相关的肾小球、肾小管和肾间质细胞的基因生物标志物升高指数，来早期发现慢性肾功能损伤出现，及时预警病人，并施以有效处理和治疗，避免或延缓不可逆的严重后果。
技术实现思路
1、本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种糖尿病慢性肾功能损伤检测/监控的检测试剂盒。通过无创的尿液取样，检测尿液脱落细胞中特定的与慢性肾损伤相关的基因生物标记物的升高指数，来获得对早期慢性肾功能损伤的发现和疗效的监控。
2、近年来，一系列与慢性肾损伤相关的蛋白质和基因生物标记物被发现和报道，在动物实验和临床实验中得到证实。这些标志物分别产生于肾脏不同部位的细胞(参见图1(a)和图1(b))，在肾脏受损的较早期就会出现在尿液中。病变累及部位的受损上皮细胞会脱落在尿液中，所以在慢性肾脏受损的病人尿液中，往往会有较多量的脱落细胞和细胞碎片。通过采用现代分子诊断学的手段和自行设计的pcr引物和探针，发展一种在尿液脱落细胞中检测一系列与慢性肾损伤相关的基因标志物的方法和试剂盒，如mu-gst,clusterin,wt-1,podocin和col4a4等等，只要在样本中汲取1.5毫升尿液，采用荧光定量rt-pcr技术，可快速灵敏地同时检测上述一系列慢性肾损伤相关标记物，对慢性肾损伤作出早期判定，根据脱落细胞中各个标记物表达量的变异，提示慢性肾损伤的可能累及部位。尿液取样简单无损伤，容易被病人接受。成本低，益于临床推广。
3、本专利技术一方面提供了一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤生物标志物的检测试剂盒，慢性肾功能损伤多由ii型糖尿病或并发高血压引起，包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述慢性肾功能损伤生物标志物的引物和探针，所述慢性肾功能损伤生物标志物为选自基因mu-gst,clusterin,wt-1,podocin和col4a4中的至少一种；
4、用于检测所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物包括：
5、用于检测mu-gst的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:1和seqid no:2所示；
6、用于检测clusterin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示；
7、用于检测wt-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:5和seq idno:6所示；
8、用于检测col4a4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:7和seqid no:8所示；
9、用于检测pododin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:9和seqid no:10所示；
10、引物序列：
11、
12、
13、用于检测所述生物标志物的探针，对应于mu-gst,clusterin,wt-1，col4a4和podocin，所述探针的核苷酸序列分别为探针seq id no:1、探针seq id no:3、探针seq idno:5、探针seq id no:7、和探针seq id no:10；
14、探针序列
15、
16、
17、本专利技术的第二方面提供包含所述引物和/或所述探针的检测试剂或检测试剂盒。
18、本专利技术的第三方面提供一种用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒，包括尿液样本采集试剂盒、rna提取试剂盒和如第二方面所述的检测试剂盒。
19、本专利技术的第四方面用于提供与所述测试试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量pcr扩增体系构成的反应体系，所述反应体系如下：
20、反转录反应体系：
21、 试剂 使用量 5×gdnaeraserbuffer 2.0μl gdnaeraser 1.0μl totalrna 7ul rnasefreedh2o 10μl
22、以上试剂来源于takara公司的primescripttmrt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)试剂盒；配制好的反向转录体系以dnase去除其中的dna(42℃2min),转于4℃,短暂低速离心后，置于pcr仪器中，37℃15min，85℃5s后取出备用；
23、所述荧光定量pcr扩增体系为：
24、
25本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的检测试剂盒，所述慢性肾功能损伤由II型糖尿病或并发高血压引起，其特征在于，包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物和探针，所述慢性肾功能损伤基因生物标志物为选自表达基因Mu-GST,Clusterin,WT-1，COL4A4和Podocin中的至少一种；
2.一种包含权利要求1所述探针的检测试剂或检测试剂盒。
3.一种用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒，其特征在于，包括尿液样本采集盒、RNA提取试剂盒和如权利要求2所述的检测试剂盒。
4.一种与权利要求2所述检测试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量PCR扩增体系构成的反应体系，其特征在于，所述反应体系如下：
5.一种权利要求1所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物检测试剂盒用于诊断糖尿病慢性肾功能损伤中的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液，尿液量>
7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤b)中所述脱落细胞分离方法为低速离心。
8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤d)中检测标志物表达水平的方法为荧光定量RT-PCR探针法。
9.一种电子，其特征在于，包括处理器和存储器，所述存储器存储有多条指令，所述处理器用于读取所述指令并执行如权利要求5-8任一所述的使用方法。
10.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有多条指令，所述多条指令可被处理器读取并执行如权利要求5-8任一所述的使用方法。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的检测试剂盒，所述慢性肾功能损伤由ii型糖尿病或并发高血压引起，其特征在于，包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物和探针，所述慢性肾功能损伤基因生物标志物为选自表达基因mu-gst,clusterin,wt-1，col4a4和podocin中的至少一种；
2.一种包含权利要求1所述探针的检测试剂或检测试剂盒。
3.一种用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒，其特征在于，包括尿液样本采集盒、rna提取试剂盒和如权利要求2所述的检测试剂盒。
4.一种与权利要求2所述检测试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量pcr扩增体系构成的反应体系，其特征在于，所述反应体系如下：
5.一种权利要求1所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐欣，朱民，彭树林，谢旻玥，雷芙蓉，
申请(专利权)人：上海力拜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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