【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种胰岛素缀合物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志，可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一，它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。
2、胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，外源性胰岛素及胰岛素衍生物主要用来治疗糖尿病。胰岛素由a、b两个肽链组成，人胰岛素(insulin human)a链有11种21个氨基酸，b链有15种30个氨基酸，共51个氨基酸；其中a7(cys)-b7(cys)、a20(cys)-b19(cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使a、b两链连接起来，此外a链中a6(cys)与a11(cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上的特异受体结合而启动的；胰岛素受体为胰岛素起作用的靶细胞膜上特定部位，仅可与胰岛素或含有胰岛素分子的胰岛素原结合，具有高度的特异性。
3、胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，glp-1)是一种由肠道l细胞分泌的促胰素，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。因此，glp-1及其类似物和衍生物在治疗
4、目前，鲜有关于胰岛素和glp-1相关多肽缀合物相关的研究和报道，鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种胰岛素和glp-1(7-37)相关多肽药物的缀合物，该缀合物通过特定的连接肽将胰岛素类似物和glp-1(7-37)类似物连接而成。本专利技术的缀合物将两者缀合修饰，在具备完全的降糖效力的胰岛素基础上，引入后者的靶点活性，能起到降低患者食欲、减轻体重的作用，解决传统的胰岛素及其衍生物使用会引起患者体重增加的副作用的问题。
2、本专利技术缀合物中的胰岛素衍生物可以是天然胰岛素或胰岛素类似物，更优选为具备长效作用的胰岛素类似物。
3、如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指与天然胰岛素具有至少80％氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸残基上的一些基团可以被化学取代、缺失或修饰，并且该衍生物具有调节体内血糖水平的功能。
4、术语“glp-1(7-37)类似物”是指是指在人天然glp-1(7-37)基础上，通过添加、删除或突变一到多个氨基酸得到的类似物。
5、术语“胰岛素缀合物”是指胰岛素与其他多肽以共价键(包括linker)相互连结而形成的多肽。
6、术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808da的a链(glyal-asna21)和b链(pheb1-thrb30)。该分子通过两个链间(a20-b19，a7-b7)和一个链内二硫键(a6-a11)稳定。本专利技术的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本专利技术的各种实施方式中，胰岛素可以是人胰岛素。
7、术语“促包涵体序列”是指连接在目的蛋白或多肽前，用于促进包涵体表达或形成的多肽序列。
8、术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。
9、本专利技术第一方面提出一种胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，胰岛素缀合物的氨基酸结构如下所示：
10、glp-1(7-37)类似物-(gqap)3-胰岛素类似物；
11、即，glp-1(7-37)类似物、氨基酸序列为(gqap)3的连接肽和胰岛素类似物通过共价键依次连接，(gqap)3分别与胰岛素b链的n末端和glp-1(7-37)类似物的c末端相连。
12、其中，本专利技术中的胰岛素类似物由胰岛素a链和胰岛素b链组成，胰岛素a链的氨基酸序列如seq id no:2所示，胰岛素b链的氨基酸序列如seq id no:3所示；胰岛素b链和胰岛素a链通过分子间二硫键相连。
13、进一步优选的，胰岛素b链的赖氨酸的ε-氨基上连接有脂肪酸侧链，以延长其作用时间，达到长效效果。
14、作为本专利技术的一个优选的技术方案，glp-1(7-37)类似物的氨基酸序列如seq idno:1所示。
15、作为本专利技术的又一优选的技术方案，脂肪酸侧链可以采用cooh(ch2)14～20co-γ-glu-aeea-aeea-；优选采用cooh(ch2)18～20co-γ-glu-aeea-aeea-；进一步优选采用cooh(ch2)18co-γ-glu-aeea-aeea-。
16、其中，aeea是指2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
17、本专利技术的胰岛素上部分氨基酸使用代号如a7、b7、a20和b19表示，上述数字中a和b分别代表胰岛素a链和胰岛素b链，而其中的数字则表示对应天然人胰岛素a链和天然人胰岛素b链的氨基酸的位置。如a7表示在胰岛素序列中，对应天然人胰岛素a链第7位的氨基酸；b7表示在胰岛素序列中，对应天然人胰岛素b链第7位的氨基酸。对于天然人胰岛素而言，a7、b7、a20和b19均为半胱氨酸(cys)，并分别利用半胱氨酸的巯基在a7(cys)-b7(cys)、a20(cys)-b19(cys)之间形成两个二硫键，使a、b两链连接起来，此外a链中a6(cys)与a11(cys)之间也存在一个二硫键；本专利技术衍生物中的胰岛素类似物部分，同样利用上述二硫键相连。
18、第二方面，本专利技术还提供了一种含有胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐的可溶性药物组合物。该药物组合物中还包括药学上可接受的辅料，辅料包括防腐剂、渗透压调节剂；防腐剂可以是苯酚和/或间甲酚，渗透压调节剂是甘油。优选地，辅料包括苯酚、间甲酚和甘油。更优选地，辅料包括苯酚和甘油。优选地，本专利技术可溶性药物组合物的ph＝7～8.5，优选为7.5～8.5，或7.8～8.5，或7.8～8.3。
19、进一步地，本专利技术提供了可溶性药物组合物包含多于2个锌原子/6分子胰岛素缀合物；优选为2～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或4～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或5～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或8～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物，或8～10个锌原子/6分子胰岛素缀合物。
20、本专利技术还提供该胰岛素缀合物的制备方法，方法可以采用化学合成法，也可以采用制备重组基因工程菌发酵表达法。
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1.一种胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，所述胰岛素缀合物的氨基酸结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种含有如权利要求1～2任一项所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐的可溶性药物组合物，其特征在于，所述可溶性药物组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括防腐剂和渗透压调节剂中的至少一种；
4.根据权利要求3所述的可溶性药物组合物，其特征在于，所述组合物包含2～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物；
5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由促包涵体序列、酶切位点片段和胰岛素缀合物前体依次连接而成；所述促包涵体序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述酶切位点片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述胰岛素缀合物前体的氨基酸结构如下所示：
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述GLP-1(7-37)类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.一种用于编码权利要求6或7所述的融合蛋白的多核苷酸片段，其特征在于，所述多核苷酸片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.8。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求8所述的多核苷酸片段。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自重组pET-28a(+)表达载体、重组pET-30a(+)表达载体、重组pET-32a(+)表达载体。
11.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含如权利要求9或10所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)。
12.根据权利要求11所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：
13.一种胰岛素缀合物的制备方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：
15.如权利要求1～3任一项所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐、或如权利要求4所述的药物组合物在制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，所述胰岛素缀合物的氨基酸结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述glp-1(7-37)类似物的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3.一种含有如权利要求1～2任一项所述的胰岛素缀合物或其药学上可接受的盐的可溶性药物组合物，其特征在于，所述可溶性药物组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括防腐剂和渗透压调节剂中的至少一种；
4.根据权利要求3所述的可溶性药物组合物，其特征在于，所述组合物包含2～12个锌原子/6分子胰岛素缀合物；
5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由促包涵体序列、酶切位点片段和胰岛素缀合物前体依次连接而成；所述促包涵体序列的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述酶切位点片段的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述胰岛素缀合物前体的氨基酸结构如下所示：
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述glp-1(7-37)类似物的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，连婕妮，王冠，张海波，王雪，
申请(专利权)人：北京惠之衡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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