一种门冬胰岛素结晶工艺制造技术

本发明专利技术提供一种门冬胰岛素结晶的制备方法及其应用。本发明专利技术的结晶方法不使用有机溶剂，通过两种溶液混合方式制备结晶，并通过优化结晶体系，从含有门冬胰岛素、甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠、氯化锌和硫酸鱼精蛋白的结晶液中，得到稳定的门冬胰岛素结晶。本发明专利技术方法制备的门冬胰岛素结晶形状规则、大小均一，制备方法生产效率高，便于工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种门冬胰岛素结晶工艺
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人胰岛素类似物及其结晶方法和应用，更具体的说，涉及一种门冬胰岛素结晶工艺。
技术介绍
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，主要特征为慢性高血糖造成的多饮多食却多尿消瘦。糖尿病的主要病因是人体胰岛素分泌绝对不足或相对不足，和/或人体功能受损导致对胰岛素利用产生障碍引起的。糖尿病导致人体对碳水化合物、蛋白质及脂肪代谢紊乱，尤其以高血糖为主要标志，并进一步导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是由A链和B链两条肽链组成，共有51个氨基酸残基。A、B链之间有A7-B7和A20-B19四个Cys的巯基构成两对二硫键，A链内A6-A11两个Cys有一对链内二硫键。胰岛素一直被认为是治疗糖尿病以及控制糖尿病患者血糖的最重要治疗药物。通过模拟人体生理性胰岛素分泌的情况来满足能量代谢的需要。对于糖尿病患者来说，胰岛素已成为较为理想的治疗方法。胰岛素应用于临床90年共经历了三代里程碑式的进步，基因重组技术的发展使胰岛素制剂从第一代胰岛素-动物胰岛素到第二代胰岛素-人胰岛素，再到第三代胰岛素-胰岛素类似物。这一变化过程显示人们追求生理性降糖，并不断研发更好模拟正常人体生理降糖模式的胰岛素用于糖尿病治疗。门冬胰岛素是一种速效胰岛素，与人胰岛素不同之处在于将人胰岛素氨基酸链B28位的脯氨酸用带负电荷的门冬氨酸取代，氨基酸替换影响了胰岛素自我聚合成为六聚体的能力。因此，与可溶性人胰岛素相比，其皮下吸收速度更快，降血糖作用更为快速有效。为了满足临床患者需要，在速效、中效和长效胰岛素的基础上，进一步发展出将两种作用时间不同胰岛素预先混合的胰岛素制剂，称为预混胰岛素。预混胰岛素制剂中，不同胰岛素特性不同，部分胰岛素需要以结晶形式悬浮于胰岛素制剂中。专利CN101035557B中公开了一种结晶门冬胰岛素及其制剂的方法，但该方法中直接将碱性溶液和酸性溶液混合后制备结晶，难以有效控制溶液中结晶胰岛素含量。专利CN103342746B同样公开了一种稳定的门冬胰岛素结晶方法，但该方法中用到了有机溶剂，有机溶剂残留会严重影响胰岛素产品质量。因此，无论是临床需要还是工业生产需要，仍需要一种稳定的门冬胰岛素结晶方法，无需或减少有机溶剂用量，且更有利于精确控制制剂中结晶悬浮的量。
技术实现思路
如上所述，在包含结晶体的胰岛素制剂或胰岛素预混制剂中，胰岛素或其衍生物的结晶体质量直接决定了最终制剂产品的质量，因此，得到形状规则、大小均一的稳定胰岛素结晶是必须的。鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种制备稳定的门冬胰岛素（重组AspB28-人胰岛素）结晶的方法。本专利技术的制备得到的门冬胰岛素结晶规则，大小均一，且能够直接用于胰岛素制剂或胰岛素预混制剂。本专利技术所指门冬胰岛素是指用生物技术将人胰岛素B链中第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸（Asp）获得的重组胰岛素。门冬胰岛素比人胰岛素起效更快，持续时间更短，一般餐前使用。一方面，本专利技术的目的在于提供一种门冬胰岛素的结晶方法，所述方法包括如下步骤：（1）称取门冬胰岛素、甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌；（2）用适量稀盐酸充分溶解所述门冬胰岛素，配制成门冬胰岛素溶液；用适量超纯水溶解步骤（1）中称取的甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌，得辅料溶液；将所述门冬胰岛素溶液与辅料溶液混合，超纯水定容，并用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0-8.0后；所述稀盐酸浓度为0.05-0.15mol/L，所述氢氧化钠溶液浓度为0.3-0.6M；（3）取硫酸鱼精蛋白，溶胀后，使用超纯水配制成硫酸鱼精蛋白溶液；所述步骤（2）中的混合溶液与硫酸鱼精蛋白溶液体积比为3:1-7:1；（4）将步骤（2）获得的混合溶液与步骤（3）获得的硫酸鱼精蛋白溶液混合制备得到结晶溶液，结晶溶液结晶30-48h，得所述门冬胰岛素结晶。优选地，步骤（4）中所述的结晶溶液中，各成分的浓度为：门冬胰岛素2.5-4.0mg/ml、硫酸鱼精蛋白0.3-0.5mg/ml、甘油12-20mg/ml、苯酚1-2mg/ml、间甲酚1.5-2.0mg/ml、氯化钠0.5-1.5mg/ml、二水磷酸氢二钠1.5-3.0mg/ml；氯化锌添加量为使溶液中锌含量为13-26.1μg/ml。进一步优选地，步骤（4）中所述的结晶溶液中，各成分的浓度为：门冬胰岛素3.5mg/ml、硫酸鱼精蛋白0.46mg/ml、甘油16mg/ml、苯酚1.50mg/ml、间甲酚1.72mg/ml、氯化钠0.877mg/ml、二水磷酸氢二钠1.79mg/ml；氯化锌添加量为使溶液中锌含量为19.6μg/ml。进一步优选地，步骤（4）中所述的结晶溶液中，各成分的浓度为：门冬胰岛素3.5mg/ml、硫酸鱼精蛋白0.46mg/ml、甘油16mg/ml、苯酚1.50mg/ml、间甲酚1.72mg/ml、氯化钠1.17mg/ml、二水磷酸氢二钠2.5mg/ml；氯化锌添加量为使溶液中锌含量为19.6μg/ml。优选地，步骤（2）中所述pH值优选为7.10-7.44。优选地，步骤（2）中所述稀盐酸浓度为0.1mol/L，所述氢氧化钠溶液浓度为0.5M。优选地，步骤（2）中的混合溶液与步骤（3）中硫酸鱼精蛋白溶液体积比优选为4:1-6:1，更优选为4:1或6:1。本专利技术中，结晶体系中各成分组成及浓度是门冬胰岛素形成稳定结晶的重要参数，尤其是其中二水磷酸氢二钠的浓度，对稳定晶型的形成影响明显；较低浓度的磷酸氢二钠溶液，难以形成棒状晶体。另一方面，本专利技术中，硫酸鱼精蛋白的添加体系同样是门冬胰岛素形成稳定结晶的重要因素；实验证实，选择仅超纯水溶解硫酸鱼精蛋白的体系，对形成大一均一的稳定晶型影响显著。本专利技术相对于现有技术具有如下优点及效果：（1）本专利技术提供的门冬胰岛素结晶体系，克服了现有技术中不能高效和定量结晶门冬胰岛素的缺陷；（2）本专利技术制备得到的门冬胰岛素晶体成棒状结构且均一稳定，生产效率高；（3）本专利技术制备的结晶门冬胰岛素可直接用于各种制剂生产，生产效率高，适于门冬胰岛素及其制剂的工业化生产需求。附图说明图1：实施例1所述方法制备的门冬胰岛素结晶图；图2：实施例2所述方法制备的门冬胰岛素结晶图；图3：实施例3所述方法制备的门冬胰岛素结晶图；图4：实施例4所述方法制备的门冬胰岛素结晶图；图5：实施例5所述方法制备的门冬胰岛素结晶图。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细的描述，实施例仅用于证明本专利技术的有益效果，不对本专利技术产生任何限制。实施例1按照如下方法制备门冬胰岛素结晶：（1）称本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种门冬胰岛素的结晶方法，所述方法包括如下步骤：/n（1）称取门冬胰岛素、甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌；/n（2）用适量稀盐酸充分溶解所述门冬胰岛素，配制成门冬胰岛素溶液；用适量超纯水溶解步骤（1）中称取的甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌，得辅料溶液；将所述门冬胰岛素溶液与辅料溶液混合，超纯水定容，并用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0-8.0；所述稀盐酸浓度为0.05-0.15mol/L，所述氢氧化钠溶液浓度为0.3-0.6M；/n（3）取硫酸鱼精蛋白，溶胀后，使用超纯水配制成硫酸鱼精蛋白溶液；所述步骤（2）中的混合溶液与硫酸鱼精蛋白溶液体积比为3:1-7:1；/n（4）将步骤（2）获得的混合溶液与步骤（3）获得的硫酸鱼精蛋白溶液混合制备得到结晶溶液，结晶溶液结晶30-48h，得所述门冬胰岛素结晶；/n其中，步骤（4）中所述的结晶溶液中，各成分的浓度为：门冬胰岛素2.5-4.0mg/ml、硫酸鱼精蛋白0.3-0.5mg/ml、甘油12-20mg/ml、苯酚1-2mg/ml、间甲酚1.5-2.0mg/ml、氯化钠0.5-1.5mg/ml、二水磷酸氢二钠1.5-3.0mg/ml；氯化锌添加量为使溶液中锌含量为13-26.1μg /ml。/n...

【技术特征摘要】
1.一种门冬胰岛素的结晶方法，所述方法包括如下步骤：
（1）称取门冬胰岛素、甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌；
（2）用适量稀盐酸充分溶解所述门冬胰岛素，配制成门冬胰岛素溶液；用适量超纯水溶解步骤（1）中称取的甘油、苯酚、间甲酚、氯化钠、二水磷酸氢二钠和氯化锌，得辅料溶液；将所述门冬胰岛素溶液与辅料溶液混合，超纯水定容，并用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0-8.0；所述稀盐酸浓度为0.05-0.15mol/L，所述氢氧化钠溶液浓度为0.3-0.6M；
（3）取硫酸鱼精蛋白，溶胀后，使用超纯水配制成硫酸鱼精蛋白溶液；所述步骤（2）中的混合溶液与硫酸鱼精蛋白溶液体积比为3:1-7:1；
（4）将步骤（2）获得的混合溶液与步骤（3）获得的硫酸鱼精蛋白溶液混合制备得到结晶溶液，结晶溶液结晶30-48h，得所述门冬胰岛素结晶；
其中，步骤（4）中所述的结晶溶液中，各成分的浓度为：门冬胰岛素2.5-4.0mg/ml、硫酸鱼精蛋白0.3-0.5mg/ml、甘油12-20mg/ml、苯酚1-2mg/ml、间甲酚1.5-2.0mg/ml、氯化钠0.5-1.5mg/ml、二水磷酸氢二钠1.5-3.0mg/ml；氯化锌添加量为使溶液中锌含量为13-26.1μg/ml。


2.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，顾志强，安丰伟，詹巾卓，黄蓉，
申请(专利权)人：北京惠之衡生物科技有限公司，吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11