【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、特别是考虑到其作为治疗方式的日益增加的重要性，用于制造rna的技术非常重要且很有价值。
技术实现思路
1、本公开提供了与用于制造rna、特别是治疗性rna(例如，治疗性mrna)的技术相关的某些见解。在一些实施方案中，当用于例如治疗级rna的大规模生产时，所提供的技术特别有用，和/或提供令人惊讶的益处和/或优点。
2、例如，本公开提供了关于体外转录(ivt)反应混合物中特别有用的胞苷三磷酸(ctp)和/或腺苷三磷酸(atp)浓度的见解(例如，在初始反应混合物中，本领域技术人员应理解，ntp在反应过程中被利用，因此它们的浓度随着时间的推移而降低，除非补充)。
3、在一些实施方案中，本公开提供了改善rna产率、rna完整性、rna加帽水平和/或效率中的一个或多个的技术；可替代地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了降低一种或多种污染物或异常产物(例如，dsrna)的水平的技术。
4、在一些实施方案中，本公开提供了独立于反应中产生的rna转录物的序列而有用的ivt反应条件(例如，反应混合物中的核苷酸浓度)。
5、本公开涵盖了对通过ivt产生rna的问题的认识，特别是在大规模(例如，商业规模)上。除其他之外，本公开确定，以高产率和/或完整性和/或低异常产物(例如，双链rna(dsrna))水平产生体外转录的rna可能具有挑战性。本公开特别认识到，在产生治疗性(例如，用于施用于动物，特别是人)rna(例如，mrna)时，尤其是
6、在一些实施方案中，所提供的技术在应用于产生具有相对高的c和/或a含量(例如，相对于转录物中的g和/或u含量)的转录物时可以是有用的。然而，在一些实施方案中，本公开提供了令人惊讶的见解，即所提供的反应条件(例如，反应混合物中的ctp和/或atp[或其类似物]水平[例如，绝对和/或相对水平])可以是独立于转录序列而有用的。
7、在一些实施方案中，如本文所述的升高的ctp和/或atp改善产率和/或完整性和/或加帽，和/或减少一种或多种异常产物(例如，dsrna)的产生；在一些实施方案中，独立于所产生的rna中的核苷酸的百分比和/或摩尔比(例如，核苷酸含量)。
8、在一些实施方案中，本文提供的技术对于以商业质量和/或商业规模制造rna特别有用。本领域技术人员将意识到，不同的治疗性rna以迥然不同的规模使用。例如，受试者特异性rna已有所描述并用于个体化的癌症疫苗中(参见，例如ro7198457)；这些rna的制造规模只需足以治疗相关个体即可。相比之下，出于其他目的，例如作为一般癌症疫苗、作为感染原疫苗、作为用于表达抗体、酶、细胞因子等的载体开发的rna通常可大规模制造。治疗性rna已被证明在最近的sars-cov-2大流行中特别有价值，需要以前所未有的规模进行制造。在各种实施方案中，本文提供的技术可在这些规模中的每一个上使用。因此，例如在一些实施方案中，本文所述的技术可用于产生在约0.01g/h rna至约1g/h rna、1g/h rna至约100g/hrna、约1g rna/h至约20g rna/h、或约100g rna/h至约10,000g rna/h)的rna(如，以制造规模)。在一些实施方案中，在每批次产生数十或数百毫克至数十或数百克(或更多)rna的反应中利用本文所述的技术。阅读本公开的本领域技术人员将认识到，所实现的某些益处(例如，改善的完整性和/或产率)在药物级制造的背景下和/或特别是在如本文所述的大规模上可以是特别有利的。
9、在一些实施方案中，可以并行地利用本文所述的技术，例如以进一步改善通量容量。
10、在一些特定实施方案中，所提供的技术可用于制造批量大小为至少0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g rna(包括，例如，至少15g rna、至少20g rna、至少25g rna、至少30g rna、至少35grna、至少40g rna、至少45g rna、至少50g rna、至少55g rna、至少60g rna、至少70g rna、至少80g rna、至少90g rna、至少100g rna、至少150g rna、至少200g rna、至少300g rna、至少400g rna、至少500g rna、至少750g、至少1kg、至少1.1kg、至少1.2kg、至少1.3kg、至少1.4kg、至少1.5kg或更多)的rna制剂(例如，rna药物物质)。在一些实施方案中，本文提供的技术可以用于产生在约0.01g g至约500g rna、约0.01g至约10g rna、约1g至约10g rna、约10g至约500g rna、约10g至约300g rna、约10g至约200g rna或约30g至约60g rna范围内的批量大小。
11、在一些实施方案中，本文提供的技术可用于产生至少1.5rna/h(包括，例如，至少2g rna/h、至少2.5g rna/h、至少3g rna/h、至少3.5g rna/h、至少4g rna/h、至少4.5grna/h、至少5g rna/h、至少5.5g rna/h、至少6g rna/h、至少6.5g rna/h、至少7g rna/h、至少7.5g rna/h、至少8g rna/h、至少8.5g rna/h、至少9g rna/h、至少10g rna/h或更高)的质量通量(mass throughput)的大规模制造。在一些实施方案中，本文所述的大规模制造方法可以达到15g rna/h至20g rna/h(例如，约17g/小时)的容量。
12、事实上，在一些实施方案中，所提供的技术提供了令人惊讶的优点，即它们可用于各种规模和/或特别是非常大的制造规模(例如，超过约数十或甚至数百克/批)，和/或是基本上独立于rna序列而有用的(例如，即使在如此大的规模下)(例如，以用于产生具有各种c和/或a含量的rna)。
13、在一些方面，本公开提供了通过体外转录产生核糖核酸(rna)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成rna分子，反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：总胞苷三磷酸(ctp)和/或一种或多种功能性ctp类似物与总鸟苷三磷酸(gtp)和/或一种或多种功能性gtp类似物的摩尔比a；和/或总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物与总尿苷三磷酸(utp)和/或一种或多种功能性utp类似物的摩尔比b；和/或总ctp和/或一种或多种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过体外转录产生核糖核酸(RNA)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成所述RNA分子，所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：
2.如权利要求1所述的方法，其中a为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中a为至少1.5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.20倍。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
8.如权利要求
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.20倍。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中c为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中c为至少1.25。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.20倍。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括将以下各项合并到所述反应混合物中：
18.如权利要求17所述的方法，其中d为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中d为至少1.20。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.20倍。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中e为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中e为至少1.20。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.20倍。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物添加到所述反应混合物中。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种通过体外转录产生核糖核酸(rna)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成所述rna分子，所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：
2.如权利要求1所述的方法，其中a为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中a为至少1.5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.20倍。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中b为至少1.5。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.20倍。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中c为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中c为至少1.25。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.20倍。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括将以下各项合并到所述反应混合物中：
18.如权利要求17所述的方法，其中d为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中d为至少1.20。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.20倍。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中e为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中e为至少1.20。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.20倍。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物添加到所述反应混合物中。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物添加到所述反应混合物中。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总utp和/或一种或多种功能性utp类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总utp和/或一种或多种功能性utp类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总utp和/或一种或多种功能性utp类似物添加到所述反应混合物中。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总atp和/或一种或多种功能性atp类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总atp和/或一种或多种功能性atp类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总atp和/或一种或多种功能性atp类似物添加到所述反应混合物中。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述rna分子是单链的。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述rna分子是线性rna、信使rna和/或核苷修饰的信使rna。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述核酸模板是dna模板。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.05-2μg/μl的所述核酸模板。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是rna聚合酶。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是t7 rna聚合酶、t3rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、n4病毒体rna聚合酶或其变体或功能结构域。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含反应缓冲液、rna酶抑制剂、焦磷酸酶、一种或多种盐、还原剂和亚精胺中的一种或多种。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述反应缓冲液包含hepes、tris-hcl或pbs。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为20-60mm的所述反应缓冲液。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液的ph为7-9。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.01-0.1u/μl的所述rna酶抑制剂。
47.如权利要求46所述的方法，其中一个单位(u)的所述rna酶抑制剂将5ng的rna酶a的活性抑制至少50％。
48.如权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述焦磷酸酶是无机焦磷酸酶。
49.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.01-0.2mu/μl的所述焦磷酸酶。
50.如权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种盐包括一种或多种镁盐和/或一种或多种钙盐。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种镁盐包括乙酸镁或氯化镁。
52.如权利要求42-51中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为20-60mm的所述一种或多种盐。
53.如权利要求42-52中任一项所述的方法，其中所述还原剂包括二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
54.如权利要求42-53中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为5-15mm的所述还原剂。
55.如权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.5-3mm的所述亚精胺。
56.如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中体外转录进行至少20-180分钟。
57.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其中体外转录在25-55℃的温度下进行。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其还包括在所述rna分子的体外转录后消化所述核酸模板。
59.如权利要求58所述的方法，其中通过dna酶消化所述核酸模板。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述dna酶包括dna酶i。
61.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其还包括在所述rna分子的体外转录后消化所述核酸聚合酶。
62.如权利要求61所述的方法，其中通过蛋白酶消化所述核酸聚合酶。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述蛋白酶包括蛋白酶k。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法，其还包括评估用于所述rna分子的体外转录的一个或多个质量控制参数。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述用于体外转录的一个或多个质量控制参数包括转录期间和/或之后所述rna分子的rna完整性、r...
【专利技术属性】
技术研发人员：I·拉贝，M·布夫，T·齐根哈尔斯，J·德勒格米勒，A·库恩，S·费塞尔，R·G·库姆斯，N·埃施曼，J·A·S·罗明，J·K·威廉森，
申请(专利权)人：生物技术欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：
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