包含RNA的LNP组合物及其制备、储存和使用方法技术

本发明专利技术一般涉及包含RNA的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的领域、制备和储存这种组合物的方法以及这种组合物在治疗中的用途。方法以及这种组合物在治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含RNA的LNP组合物及其制备、储存和使用方法


[0001]本专利技术一般涉及包含RNA的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的领域、制备和储存这种组合物的方法以及这种组合物在治疗中的用途。

技术介绍

[0002]重组核酸(如DNA或RNA)将外源遗传信息递送到靶细胞中的用途是众所周知的。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特性。RNA不需要进入细胞核才能表达，而且不能整合到宿主基因组中，从而消除了致癌等多种风险。
[0003]重组核酸可以裸核酸形式向有需要的受试者给药；然而，通常使用组合物给药重组核酸。例如，RNA可以通过含有RNA和纳米颗粒形成载体的所谓纳米颗粒制剂递送，例如阳离子脂质(例如永久带电的阳离子脂质)、阳离子脂质和一种或多种其他脂质的混合物或阳离子聚合物。此类纳米颗粒制剂的命运由不同的关键因素控制(例如，纳米颗粒的尺寸和尺寸分布等)。例如，这些因素从2018年开始在FDA的“脂质体药物产品指南(Liposome Drug Products Guidance)”中称为应分析和规定的特定属性。目前纳米颗粒制剂临床应用的局限性可能在于缺乏均匀、纯净和良好表征的纳米颗粒制剂。
[0004]与其他RNA纳米颗粒产品相比，包含可电离脂质的LNP在靶向和功效方面可以显示出优势。然而，要获得常规药物使用所需的足够保质期是一项挑战。据说，为了稳定，包含可电离脂质的LNP需要在更低的温度下冷冻，如
‑
80℃，这对冷链构成了重大挑战，或者它们只能储存在冷冻温度以上，如5℃，在此温度只能获得有限的稳定性。
[0005]已知在溶液或LNP中的RNA经历缓慢的片段化。此外，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的存在下，RNA倾向于采用非常稳定的折叠形式，这很难进行翻译。这两种机制，即片段化和这种稳定RNA折叠的形成，都是温度依赖性的，并导致完整和可获得的RNA的损失，从而限制了液体产品的稳定性；然而，它们在冷冻状态下基本不存在。
[0006]因此，本领域仍然需要(i)包含LNP的组合物，所述LNP包含可电离的脂质和RNA，并且所述组合物是稳定的并且可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，特别是在约
‑
25℃的温度下，或者甚至在+2至+20℃之间的温度下以液体形式储存；(ii)可即时使用的组合物；(iii)优选可重复冷冻和解冻的组合物；和(iv)制备和储存这种组合物的方法。本专利技术解决了这些和其他需求。
[0007]本专利技术人惊奇地发现本文所述的组合物和方法满足上述要求。特别地，已经证明，通过使用低浓度(例如，至多约25mM)的特定缓冲物质、特别是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)及其质子化形式，并且排除无机磷酸盐阴离子以及柠檬酸盐阴离子和EDTA的阴离子，可以制备稳定的并且可以在约
‑
25℃甚至以液体形式储存的组合物。

技术实现思路

[0008]第一方面，本专利技术提供了一种组合物，其包含分散在水相中的脂质纳米颗粒(LNP)，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统
包含选自Tris及其质子化形式、双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷(Bis
‑
Tris
‑
methane)及其质子化形式和三乙醇胺(TEA)及其质子化形式的缓冲物质，并且所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸(MES)的阴离子、3
‑
(N
‑
吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子和2
‑
[4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基]乙磺酸(HEPES)的阴离子；所述组合物中缓冲物质的浓度为至多约25mM；并且所述水相基本不含无机磷酸盐阴离子、基本不含柠檬酸盐阴离子和基本不含乙二胺四乙酸(EDTA)的阴离子。
[0009]如本申请中所证实的，在包含LNP的组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式的RNA的形成。此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过简单地降低包含LNP和缓冲系统的组合物中缓冲物质的浓度，其中LNP包含阳离子可电离脂质和RNA，与含有浓度为50mM的相同缓冲物质的组合物相比，在冷冻
‑
解冻循环后，可以获得具有改进的RNA完整性的RNA LNP组合物。因此，所要求保护的组合物提供了改进的稳定性，可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型(ready
‑
to
‑
use)组合物。
[0010]在第一方面的优选实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，即Tris及其质子化形式的混合物。
[0011]在一个实施方案中，所述单价阴离子选自氯离子(chloride)、乙酸根(acetate)、乙醇酸根(glycolate)、乳酸根(lactate)、吗啉乙磺酸根和3
‑
(N
‑
吗啉代)丙磺酸根(morpholinoethanesulfonate)，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2
‑
[4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基]乙磺酸根(2
‑
[4
‑
(2
‑
hydroxyethyl)piperazin
‑1‑
yl]ethanesulfonate)，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根和乳酸根，如氯离子或乙酸根。
[0012]在一个实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，并且所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和3
‑
(N
‑
吗啉代)丙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2
‑
[4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基]乙磺酸根，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根和乳酸根，如氯离子或乙酸根。
[0013]在第一方面的一个实施方案中，在所述组合物中缓冲物质的浓度、特别是Tris及其质子化形式的总浓度，为至多约20mM，例如至多约19mM、至多约18mM、至多约17mM、至多约16mM、至多约15mM、至多14mM、至多约13mM、至多12mM、最约11mM或至多约10mM。在一个实施方案中，在所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的下限是至少约1mM，优选至少约2mM，例如至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM或至少约9mM。例如，在所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含分散在水相中的脂质纳米颗粒(LNP)，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质和单价阴离子，所述缓冲物质选自三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)及其质子化形式，双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷(Bis
‑
Tris
‑
甲烷)及其质子化形式、以及三乙醇胺(TEA)及其质子化形式，并且所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸(MES)的阴离子、3
‑
(N
‑
吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子和2
‑
[4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
基]乙磺酸(HEPES)的阴离子；所述组合物中缓冲物质的浓度至多为约25mM；并且所述水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，以及基本上不含乙二胺四乙酸(EDTA)的阴离子。2.权利要求1所述的组合物，其中所述缓冲物质为Tris及其质子化形式。3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度为至多约20mM，优选至多约15mM，更优选至多约10mM，例如约10mM。4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述水相基本上不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子，特别是基本上不含无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至多等于、优选小于所述组合物中缓冲物质的浓度，例如小于约9mM。6.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至少等于、优选高于所述组合物中缓冲物质的浓度。7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，优选在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.8之间。8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中水是所述组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂总量小于约0.5％(v/v)。9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的摩尔渗透压浓度至多约为400
×
10
‑3osmol/kg。10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，优选约10mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种化合物，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。12.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上不含冷冻保护剂。13.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L1或L2之一是
–
O(C＝O)
‑
、
‑
(C＝O)O
‑
、
‑
C(＝O)
‑
、
‑
O
‑
、
‑
S(O)
x
‑
、
‑
S
‑
S
‑
、
‑
C(＝O)S
‑
、SC(＝O)
‑
、
‑
NR
a
C(＝O)
‑
、
‑
C(＝O)NR
a
‑
、NR
a
C(＝O)NR
a
‑
、
‑
OC(＝O)NR
a
‑
或
‑
NR
a
C(＝O)O
‑
，并且L1或L2另一个是
‑
O(C＝O)
‑
、
‑
(C＝O)O
‑
、
‑
C(＝O)
‑
、
‑
O
‑
、
‑
S(O)
x
‑
、
‑
S
‑
S
‑
、
‑
C(＝O)S
‑
、SC(＝O)
‑
、
‑
NR
a
C(＝O)
‑
、
‑
C(＝O)NR
a
‑
、NR
a
C(＝O)NR
a
‑
、
‑
OC(＝O)NR
a
‑
或
‑
NR
a
C(＝O)O
‑
或直接键；G1和G2各自独立地是未取代的C1‑
C
12
亚烷基或C2‑
C
12
亚烯基；G3是C1‑
C
24
亚烷基、C2‑
C
24
亚烯基、C3‑
C8环亚烷基、C3‑
C8环亚烯基；R
a
是H或C1‑
C
12
烷基；R1和R2各自独立地是C6‑
C
24
烷基或C6‑
C
24
烯基；R3是H、OR5、CN、
‑
C(＝O)OR4、
‑
OC(＝O)R4或
‑
NR5C(＝O)R4；R4是C1‑
C
12
烷基；R5是H或C1‑
C6烷基；和x是0、1或2。15.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中：(α)所述阳离子可电离脂质选自以下结构I
‑
1至I
‑
36：
(β)所述阳离子可电离脂质选自以下结构A至F：或
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有结构I
‑
3的脂质。16.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述LNP进一步包含一种或多种其他脂质，优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述LNP包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇。17.权利要求16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选具有以下结构：或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：R
12
和R
13
各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或未饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；且w具有在30至60之间的平均值。18.权利要求16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物、聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。19.权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷基脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基
‑
磷脂酰胆碱(POPC)、1,2
‑
二
‑
O
‑
十八碳烯基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1
‑
油酰基
‑2‑
胆甾烯基半琥珀酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(OChemsPC)、1
‑
十六烷基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基
‑
磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基
‑
磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基
‑
磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基
‑
磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。20.权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。21.权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述水相不包含螯合剂。22.权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。23.权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述RNA包封在所述LNP内或与所述LNP缔合。24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1
‑
甲基
‑
假尿苷(m1ψ)和5
‑
甲基
‑
尿苷(m5U)。25.权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含以下中的至少一个、优选以下全部：5
’
帽；5
’
UTR；3
’
UTR；和poly
‑
A序列。26.权利要求25所述的组合物，其中所述poly
‑
A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述
poly
‑
A序列优选为中断的A核苷酸序列。27.权利要求25或26所述的组合物，其中所述5
’
帽是cap1或cap2结构。28.权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。29.权利要求28所述的组合物，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。30.权利要求28或29所述的组合物，其中所述RNA包含编码全长SARS
‑
CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。31.权利要求29或30所述的组合物，其中所述SARS
‑
CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性。32.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冷冻形式。33.权利要求32所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。34.权利要求32或33所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z
平均
)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z
平均
)和/或尺寸分布和/或PDI。35.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体形式。36.一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述最终水相包括最终缓冲系统，所述最终缓冲系统包含最终缓冲物质和最终单价阴离子，所述最终缓冲物质选自Tris及其质子化形式、Bis
‑
Tris甲烷及其质子化形式、TEA及其质子化形式，并且所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、MES的阴离子、MOPS的阴离子和HEPES的阴离子；所述组合物中最终缓冲物质的浓度至多为约25mM；并且所述最终水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，且基本上不含EDTA的阴离子；其中所述方法包括：(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；和(II)任选将所述制剂冷冻至约
‑
10℃或更低，从而获得所述组合物，其中步骤(I)包括：(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；(b)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；和
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。37.权利要求36所述的方法，其中步骤(I)进一步包括选自稀释和过滤的一个或多个步骤。38.权利要求36或37所述的方法，其中步骤(I)包括：(a
’
)提供RNA水溶液；(b
’
)提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；(c
’
)将根据(a
’
)提供的RNA水溶液与根据(b
’
)提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；(d
’
)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；(e
’
)将根据(c
’
)制备的RNA溶液与根据(d
’
)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；(f
’
)任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e
’
)制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；(g
’
)任选重复步骤(f
’
)一次或两次或更多次，其中在步骤(f
’
)的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每个循环中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；(h
’
)使用包含最终缓冲系统且pH值至少为6.0的最终含水缓冲溶液，如果不存在步骤(f
’
)，则过滤在步骤(e
’
)中获得的第一中间制剂，或者如果存在步骤(f
’
)而不存在步骤(g
’
)，则过滤在步骤(f
’
)中获得的另一中间制剂，或者如果存在步骤(f
’
)和(g
’
)，则过滤在步骤(g
’
)之后获得的另一中间制剂；以及(i
’
)任选使用稀释溶液稀释在步骤(h
’
)中获得的制剂；从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。39.权利要求36至38中任一项所述的方法，其中过滤是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。40.权利要求36至39中任一项所述的方法，其包括(II)将所述制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：生物技术欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：