【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术涉及生物技术的，特别是一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a及其制备方法的。
技术介绍
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技术介绍
1、肝脏是人和动物体内主要的解毒器官，对于药物、酒精、毒物、毒素的代谢和分解具有至关重要的作用，因此肝脏也是有害物质攻击的主要靶器官。氧化应激被认为是急慢性肝脏疾病的病理基础，参与肝损伤的发生和发展，可导致肝脏炎症反应、线粒体功能障碍甚至肝坏死。桑叶是中国传统的中药材，桑叶具有“疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功能”。研究表明，桑叶中的生物碱、多酚、黄酮、多糖等都对不同原因导致的肝损伤有缓解作用，其中生物碱、多酚、黄酮等均是小分子化合物，结构简单，其提取分离纯化技术较为成熟，开发利用已有较多报道。多糖是聚合度大于10的复杂大分子，分子量可高达数万以上，而结构和分子量的不同又导致其活性差异，因此特定结构和功能的均一多糖分离制备对于桑叶多糖的开发利用具有重要意义，但目前提取桑叶中特定结构的活性多糖用于治疗肝损伤的研究还非常缺乏。
技术实现思路
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技术实现思路
1、本专利技术的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种抗肝氧化损伤的桑叶多糖mbp-a及其制备方法，所制备的桑叶多糖mbp-a纯度均一，结构明确，对肝氧化损伤有显著的缓解作用，可用于护肝活性产品的开发。
2、为实现上述目的，本专利技术提出了一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a，其单糖组成为由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖＝0.395：0.162：0.170：0.109，分子
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4、其中，支链r通过→3、4)-α-l-rha-(1→的o-4键与主链连接，其结构如下：
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6、为实现上述目的，本专利技术还提出了一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a的制备方法，包括如下步骤：
7、a)将桑叶干燥后粉碎过筛，加入到水中，超声处理后，转至高压釜内经中温高压处理，离心过滤上清液，得到桑叶水提物。
8、b)将步骤a)中的桑叶水提物减压浓缩，加入乙醇，收集沉淀；
9、c)将步骤b)中的沉淀用热水溶解，冷却后用sevag法脱除蛋白质，用过氧化氢氧化脱色，再次用乙醇沉淀后，收集沉淀物，得桑叶粗多糖；
10、d)将步骤c)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，用截留分子量为10kda和50kda的超滤膜过滤，获得分子量介于10kda-50kda的截留组分。
11、e)将步骤d)中的截留组分依次通过deae-sepharose fast flow离子交换层析柱分离洗脱、透析膜除盐、brt105-104-102串联凝胶柱纯化、再次透析膜除盐后，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a。
12、作为优选，所述步骤a)中，桑叶的干燥方式为烘箱温度50～60℃，过筛目数50～80目，加入水的质量体积比1：20～1：50，超声时间30～60min，高压釜中提取温度90～105℃，压力1～5mpa，提取时间30～60min。
13、作为优选，所述步骤b)中将桑叶水提物浓缩至干物质含量为20～50g/l，添加乙醇至体积分数为70～75％，在静置12～24h后离心或抽滤收集沉淀物。
14、作为优选，所述步骤c)中沉淀用热水溶解，水量以能够完全溶解沉淀的最小体积为宜，冷却后按照体积比为4：1～6：1将桑叶粗多糖水溶液与sevage溶液混合，所述sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，多糖和sevage混合物在封闭容器中剧烈振荡5～10min后离心，分离上层多糖溶液。分离的多糖溶液再次按照上述步骤加入sevage去除蛋白，重复操作6次，最后一次分离上清液后，在上清液中添加15～25％的过氧化氢，在50～65℃下水浴2～3h，放冷后，缓慢加入乙醇至体积分数为70～75％，静置12～24h后离心，收集沉淀，并用70～75％冲洗几次，得到去蛋白脱色后的桑叶粗多糖。
15、作为优选，所述步骤d)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，采用milliporelabscale tff系统先用截留分子量为10kda的超滤膜过滤，留取分子量大于10kda的部分，然后再将分子量大于10kda的部分过50kda的超滤膜，留取分子量小于50kda的部分，获得分子量介于10kda～50kda的截留组分。
16、作为优选，所述步骤e)中截留组分以5～10ml/min流速上deae-sepharose fastflow离子交换层析柱，用纯水以5～15ml/min流速冲洗deae-sepharose fast flow离子交换层析柱3倍柱床体积。随后，以5～15ml/min流速分别用0.2m nacl、0.5m nacl、1.0m nacl洗脱deae-sepharose fast flow离子交换层析柱，各洗脱液的洗脱体积均为3倍柱床体积。用苯酚硫酸法进行追踪检测洗脱液中的多糖含量，绘制绘制散点图，根据散点图峰形，收集0.2m nacl洗脱液中的主要对称峰，减压浓缩，3500da透析袋透析除盐，旋蒸浓缩后，用全自动凝胶纯化系统(brt-gs)进行纯化，结合示差检测器(ri-502shodex)收集主要对称峰。将收集液用3500da透析袋再次透析除盐，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a。
17、本专利技术的有益效果：本专利技术通过超声预处理、中温高压蒸煮、乙醇沉淀、sevag法脱蛋白、过氧化氢法脱色后从桑叶中获得粗多糖，再用超滤膜过滤截留分子量介于10kda-50kda的多糖组分，然后经过deae-sepharose fast flow离子交换层析柱分离洗脱、透析膜除盐、brt105-104-102串联凝胶柱纯化、再次透析膜除盐后，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a。该桑叶多糖mbp-a是一种由鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：甘露糖：阿拉伯糖：木糖以摩尔比为0.328：0.345：0.154：0.138：0.021：0.014组成的多糖，分子量约为48.6kda，纯度均一，其主链结构主要由半乳糖醛酸和鼠李糖组成，包含糖苷键→3)-β-l-rhap-(1、→3,4)-β-l-rhap-(1、→4)-α-d-galap-(1→、→3,4)-α-d-galap-(1→，支链主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，支链通过→3,4)-β-l-rhap-(1→的o-4键连接在主链上。该桑叶多糖mbp-a体外能够清除多种自由基，抵抗肝细胞氧化损伤，体内对药物导致的小鼠肝脏氧化损伤有显著的缓解作用，并且可以调控小鼠的肠道微生物，提高具有抗炎、抗肝损伤活性的有益菌akkermansia的相对丰度。本专利技术所制备的桑叶多糖mbp-a可用于护肝产品开发，对于桑叶中活性成分的挖掘和利用，具有积极的社会效益和经济效益。
18、本专利技术的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
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1.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A，其特征在于：所述抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A为由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖按照摩尔比0.395:0.162:0.170:0.109组成的支链多糖，分子量为48.6kDa，分子结构如下：
2.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，桑叶的干燥方式为烘箱温度50～60℃，过筛目数50～80目，加入水的质量体积比1：20～1：50，超声时间30～60min，高压釜中提取温度90～105℃，压力1～5Mpa，提取时间30～60min。
4.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤b)中水提具体为，将桑叶水提物浓缩至干物质含量为20～50g/L，添加乙醇至体积分数为70～75％，在静置12～24h后离心或抽滤收集沉淀物。
5.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中沉淀用热
6.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤d)中的桑叶粗多糖沉淀物用热水溶解，采用MilliporeLabscale TFF系统先用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤，留取分子量大于10kDa的部分，然后再将分子量大于10kDa的部分过50kDa的超滤膜，留取分子量小于50kDa的部分，获得分子量介于10kDa～50kDa的截留组分。
7.如权利要求2至6中任一项所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A的制备方法，其特征在于：所述步骤e)中截留组分以5～10mL/min流速上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用纯水以5～15mL/min流速冲洗DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱3倍柱床体积。随后，以5～15mL/min流速分别用0.2M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl洗脱DEAE-SepharoseFast Flow离子交换层析柱，各洗脱液的洗脱体积均为3倍柱床体积。用苯酚硫酸法进行追踪检测洗脱液中的多糖含量，绘制绘制散点图，根据散点图峰形，收集0.2M NaCl洗脱液中的主要对称峰，减压浓缩，3500Da透析袋透析除盐，旋蒸浓缩后，用全自动凝胶纯化系统(BRT-GS)进行纯化，结合示差检测器(RI-502SHODEX)收集主要对称峰。将收集液用3500Da透析袋再次透析除盐，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化的抗肝氧化损伤桑叶多糖MBP-A。
...【技术特征摘要】
1.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a，其特征在于：所述抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a为由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖按照摩尔比0.395:0.162:0.170:0.109组成的支链多糖，分子量为48.6kda，分子结构如下：
2.一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，桑叶的干燥方式为烘箱温度50～60℃，过筛目数50～80目，加入水的质量体积比1：20～1：50，超声时间30～60min，高压釜中提取温度90～105℃，压力1～5mpa，提取时间30～60min。
4.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a的制备方法，其特征在于：所述步骤b)中水提具体为，将桑叶水提物浓缩至干物质含量为20～50g/l，添加乙醇至体积分数为70～75％，在静置12～24h后离心或抽滤收集沉淀物。
5.如权利要求2所述的一种抗肝氧化损伤桑叶多糖mbp-a的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中沉淀用热水溶解，水量以能够完全溶解沉淀的最小体积为宜，冷却后按照体积比为4：1～6：1将桑叶粗多糖水溶液与sevage溶液混合，所述sevage溶液中氯仿与正丁醇的质量比为5：1，多糖和sevage混合物在封闭容器中剧烈振荡5～10min后离心，分离上层多糖溶液。分离的多糖溶液再次按照上述步骤加入sevage去除蛋白，重复操作6次，最后一次分离上清液后，在上清液中添加15～25％的过氧化氢，在50～65℃下水浴2～3h，放冷后，缓慢加入乙醇至...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雨晴，钟石，霍进喜，潘美良，马焕艳，李有贵，赵辉，董馨恬，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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