【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种peg介导高粱附球菌原生质体遗传转化的方法。
技术介绍
1、附球菌属(epicoccum)隶属子囊菌门(ascomycota)，座囊菌纲(dothideomycetes)，格孢腔菌目(pleosporales)亚隔孢壳科(didymellaceae)，是一种致病性较强的菌属(chen,q.,hou,l.w.,duan,w.j.,crous,p.w.,and cai,l.2017.didymellaceaerevisited.stud.mycol.87:105-159.)。其寄主范围极其广泛，可引起玉米大小叶斑病、烟草叶斑病、水稻胡麻斑病等，同时在高粱上还可与其他病菌形成复合体引起灰霉病(chen,t.m.,xie,y.j.,sun,q.,shi,x.c.,wang,s.y.,and laborda,p.2021.first reportof epicoccumsorghinum causing leaf sheath and leaf spot on maize inchina.plant dis.105(11):3741.；yuan,g.q.,liao,t.,tan,h.w.,li,q.q.,and lin,w.2016.first report of leaf spot caused by phomasorghina on tobacco inchina.plant dis.100(8):1790；liu,l.m.,zhao,y.,zhang,y.l.,wang,l.,hou,y.x.,and
2、遗传转化技术是实现基因定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的致病机理。真菌遗传转化可通过多种方法实现，包括电转化、农杆菌转化、基因枪转化、限制性内切酶转化、peg转化。在多种转化方法中，peg转化方法具有操作简单、所需仪器容易满足等优点，广泛应用于丝状真菌遗传转化(liu,z.h.and friesen,t.l.2012.polyethylene glycol(peg)-mediated transformation in filamentousfungal pathogens.humana press.835:365-375.)。peg介导的遗传转化方法利用高浓度的聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)使细胞外二价阳离子如ca2+、mg2+、mn2+等和外源dna在细胞表面沉淀，寄主细胞膜透性改变后将外源dna吸收到细胞内(wu,s.p.,zhu,h.c.,liu,j.x.,yang,q.s.,shao,x.h.,bi,f.c.,hu,h.q.,chen,k.l.,and yi,g.j.2020.establishment of a peg-mediated protoplast transformation systembased on dna and crispr/cas9 ribonucleoprotein complexes for banana.bmc plantbiol.20(1):425.doi:10.1186/s12870-020-02609-8.)。
3、在peg介导的遗传转化过程中，原生质体的数量和外源dna在高粱附球菌的转化效率至关重要。因此，本专利技术旨在通过幼嫩菌丝培养、酶解液调配、转化子筛选检测等方面解决原生质体制备和转化中的难题，建立一个针对高粱附球菌的稳定、高效、简便的遗传转化体系，有助于病原菌致病机制、寄主抗病机制、病原寄主互作机制、农药活性评价及农药作用机制的研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种稳定、高效、简便的peg介导高粱附球菌原生质体遗传转化的方法。
2、本专利技术的技术方案是：一种高粱附球菌原生质体的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)新鲜菌丝制备：将高粱附球菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养，再用灭菌水冲洗，菌悬液转至完全液体培养基摇培，然后过滤获得高粱附球菌的新鲜菌丝；
4、(2)酶解处理：以氯化钠溶液作为渗透压稳定剂，配置崩溃酶(drislase)和溶壁酶(lysing enzyme)的混合酶解液，将步骤(1)获得的新鲜菌丝加入酶解液中，于摇床酶解；
5、(3)原生质体收集：将步骤(2)获得的酶解液过滤，所得滤液离心。
6、步骤1)中所述cm培养基按照如下方法制备：酵母粉6g，酶水解干酪素3g，酸水解干酪素3g，葡萄糖10g，加ddh2o定容至1l；摇培后菌丝需呈自然舒展状态，不宜结团。
7、步骤2)中所述原生质体酶解液按照如下方法制备：将0.5g崩溃酶和0.1g溶壁酶加入到0.7mol/l的氯化钠稳渗剂中，搅拌均匀。
8、高粱附球菌原生质体的遗传转化方法，其特征在于：包括如下顺序进行的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述CM培养基按照如下方法制备：酵母粉6g，酶水解干酪素3g，酸水解干酪素3g，葡萄糖10g，加ddH2O定容至1L；摇培后菌丝需呈自然舒展状态，不宜结团。
3.根据权利要求1所述的一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述原生质体酶解液按照如下方法制备：将0.5g崩溃酶和0.1g溶壁酶加入到0.7mol/L的氯化钠稳渗剂中，搅拌均匀。
4.如权利要求1-3任一所述方法制备的高粱附球菌原生质体的遗传转化方法，其特征在于：包括如下顺序进行的步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述的PTC按照如下方法制备：取聚乙二醇4000(PEG4000)60g溶于STC缓冲液中，定容至100mL，65℃水浴锅加热完全溶解后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的RM再生培养基按照如下方法制备：酵母1
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的继代筛选培养基为含潮霉素的PDA培养基。
8.一种如权利要求4-7任一所述方法制备的高粱附球菌原生质体的筛选方法，其特征是，包括对高粱附球菌遗传转化子进行PCR检测的步骤；其中，根据转入到高粱附球菌基因组中的外源质粒的潮霉素抗性基因(Hyg)和绿色荧光蛋白基因(GFP)序列，分别设计Hyg和GFP片段的特异性引物验证阳性遗传转化子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的PCR检测使用的引物序列如下：
...【技术特征摘要】
1.一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述cm培养基按照如下方法制备：酵母粉6g，酶水解干酪素3g，酸水解干酪素3g，葡萄糖10g，加ddh2o定容至1l；摇培后菌丝需呈自然舒展状态，不宜结团。
3.根据权利要求1所述的一种高粱附球菌原生质体的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述原生质体酶解液按照如下方法制备：将0.5g崩溃酶和0.1g溶壁酶加入到0.7mol/l的氯化钠稳渗剂中，搅拌均匀。
4.如权利要求1-3任一所述方法制备的高粱附球菌原生质体的遗传转化方法，其特征在于：包括如下顺序进行的步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述的ptc按照如下方法制备：取聚乙二醇4000(peg4000)60g溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卓，张骏，宋宝安，赵永田，李冬雪，廖康岑，刘凤华，谢文静，潘田欣宜，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：
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