【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体而言，涉及一种用于检测猪支原体和衣原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、猪作为支原体和衣原体感染的宿主之一，目前检测猪内支原体的主要方法是分离培养法。在养猪场中最主要的也是最常见的支原体为猪肺炎支原体，其次为猪鼻支原体，由于合并感染的情况愈演愈烈，近年来猪滑液支原体和猪絮状支原体也被广泛研究。猪肺炎支原体是可引起慢性呼吸道疾病支原体肺炎，猪鼻支原体和猪絮状支原体会让感染加重。猪鼻支原体可以感染人，并影响肿瘤靶向药物的治疗效果。此外，猪鼻支原体对猪絮状支原体表达了抑制行为，表明一方可以与另一方的存在竞争。猪絮状支原体与猪肺炎支原体在遗传上相近，被认为作为猪肺炎支原体的共生微生物，其毒力作用尚不清楚。猪滑液支原体感染关节和扁桃体，通常引起多发性浆膜炎和软骨病，是引起育肥猪急性和重度跛行的主要原因。
2、感染猪的衣原体种主要有猪衣原体、兽类衣原体、流产衣原体和鹦鹉热衣原体。衣原体感染自willingan da首次从猪关节炎和心包炎病灶部位分理出衣原体，后被人熟知。猪衣原体因为ompa基因的高度同源性一度被认为是沙眼衣原体，猪衣原体相比于其他的猪内衣原体具有更高的遗传多样性。猪支原体和鹦鹉热衣原体通过感染动物口腔，粪便，进行传播，可使人患病，不同衣原体物种发生在猪身上的流行率、人畜共患病风险和经济影响难以确定。
3、目前关于猪衣原体病的研究主要采用血清学方法，包括pcr、elisa和cft等，但这些方法只能判断是否有衣原体感染，由于猪衣原体和鹦鹉热衣原体的序列的相似性，某
4、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于检测猪支原体和衣原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法，以实现对猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪鼻支原体、猪衣原体和鹦鹉热衣原体进行定量、灵敏且快速的检测。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种用于检测猪支原体和衣原体的核酸组合物，其中，猪支原体包括猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体，衣原体包括猪衣原体和鹦鹉热衣原体；核酸组合物包括引物对和探针；
4、扩增猪肺炎支原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：1-2所示，探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；
5、扩增猪絮状支原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：4-5所示，探针的核苷酸序列如seq id no：6所示；
6、扩增猪滑液支原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：7-8所示，探针的核苷酸序列如seq id no：9所示；
7、扩增猪鼻支原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：10-11所示，探针的核苷酸序列如seq id no：12所示；
8、扩增猪衣原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：13-14所示，探针的核苷酸序列如seq id no：15所示；
9、扩增鹦鹉热衣原体的引物对的核苷酸序列如seq id no：16-17所示，探针的核苷酸序列如seq id no：18所示；
10、引物对中含有锁核酸修饰，引物对的核苷酸序列中+代表锁核酸修饰，修饰位置是“+”相邻的后一位碱基。
11、锁核酸(locked nucleic acid，lna)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2’-o,4’-c-亚甲基-β-d-呋喃核糖核酸单体，核糖中的2’氧原子和4’碳原子之间的亚甲基桥键，将糖环锁定成为一个双环的分子模式，从而能很好地限制糖环的灵活性，降低了核糖结构的柔韧性，并增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。lna是最新的rna类似物之一，它与dna/rna在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对dna、rna有很好的识别能力，表现出了强大的亲和力、序列特异性、热稳定性和核酸酶抗性。
12、本专利技术的专利技术人对猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪衣原体及鹦鹉热衣原体的特异性序列进行筛选，并采用锁核酸修饰，设计出对应的特异性引物和探针。采用taqman探针法在荧光定量pcr仪上扩增dna片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带存在以上6种支原体及衣原体。
13、在一些实施例中，核酸组合物用于实时定量荧光pcr中以扩增猪支原体和衣原体的核酸。
14、通过以上核酸组合物可以对生物制品中猪支原体和衣原体进行检测，相对于传统荧光定量pcr技术而言，本专利技术的核酸组合物具有更高的特异性。
15、在一些实施例中，核酸组合物中的探针的5’端各自标记有荧光报告基团，3’端各自标记有荧光淬灭基团；
16、在一些实施例中，荧光报告基团包括fam、cy5、joe和vic，荧光淬灭基团包括bhq1、bhq3和mgb。
17、第二方面，本专利技术提供了一种用于检测猪支原体和衣原体的试剂盒，其包括含有上述核酸组合物的扩增试剂。
18、在一些实施例中，核酸组合物中引物对与探针的摩尔浓度比为0.3-0.4:0.3-0.6。
19、在一些实施例中，核酸组合物中包括第一混合物和第二混合物；
20、第一混合物中包括猪肺炎支原体、猪絮状支原体和猪滑液支原体的引物对和探针，第二混合物中包括猪鼻支原体、猪衣原体和鹦鹉热衣原体的引物对和探针；
21、第一混合物中引物对和探针的摩尔浓度比为0.3-0.4:0.4-0.6，第二混合物中引物对和探针的摩尔浓度比为0.3-0.4:0.3-0.5。
22、在一些实施例中，第一混合物中猪肺炎支原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.4:0.5；猪滑液支原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.4:0.4；猪絮状支原体的引物对和探针摩尔浓度比为0.3:0.6。
23、第二混合物中猪鼻支原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.3:0.3；猪衣原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.3:0.5；鹦鹉热衣原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.4:0.5。
24、在一些实施例中，核酸扩增试剂还包括2×pro taq hs probe premix。
25、第三方面，本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测猪支原体和衣原体的核酸组合物，其特征在于，所述猪支原体包括猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体，所述衣原体包括猪衣原体和鹦鹉热衣原体；所述核酸组合物包括引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物用于实时定量荧光PCR中以扩增所述猪支原体和衣原体的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物中的探针的5’端各自标记有荧光报告基团，3’端各自标记有荧光淬灭基团；
4.一种用于检测猪支原体和衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有权利要求1-3任一项所述的核酸组合物的扩增试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合物中引物对与探针的摩尔浓度比为0.3-0.4:0.3-0.6。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合物中包括第一混合物和第二混合物；
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一混合物中猪肺炎支原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.4:0.5；所述猪滑液支原体的
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二混合物中猪鼻支原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.3:0.3；所述猪衣原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.3:0.5；所述鹦鹉热衣原体的引物对和探针的摩尔浓度比为0.4:0.5。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括2×Pro TaqHS Probe Premix。
10.一种用于猪支原体和衣原体的非疾病诊断检测方法，其特征在于，将待测样本与所述扩增试剂混合，然后通过实时定量荧光PCR检测，根据荧光扩增结果判定待测样本中是否含有猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪鼻支原体、猪衣原体和鹦鹉热衣原体；
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪支原体和衣原体的核酸组合物，其特征在于，所述猪支原体包括猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体，所述衣原体包括猪衣原体和鹦鹉热衣原体；所述核酸组合物包括引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物用于实时定量荧光pcr中以扩增所述猪支原体和衣原体的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物中的探针的5’端各自标记有荧光报告基团，3’端各自标记有荧光淬灭基团；
4.一种用于检测猪支原体和衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有权利要求1-3任一项所述的核酸组合物的扩增试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合物中引物对与探针的摩尔浓度比为0.3-0.4:0.3-0.6。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸组合物中包括第一混合物和第二混合物；
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，汪国威，闫博，杨倩倩，杨鸽，朱雨生，安宁，
申请(专利权)人：西安复盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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