【技术实现步骤摘要】
本申请涉及癌症领域，特别地涉及间皮素抗原结合结构域和包含这样的间皮素抗原结合结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)及其使用方法。
技术介绍
1、癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，每年癌症影响接近130万例新患者，并且其是继心血管疾病之后第二位的主要死亡原因，其引起大约四分之一的死亡。实体瘤是这些死亡中大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面已取得显著进展，但是在过去的20年内所有癌症的总体5年存活率仅提高约10％。癌症或恶性肿瘤转移并且以不受控制的方式迅速生长，使得治疗极其困难。
2、间皮素是40kda糖基磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，其在正常个体中的表达局限于胸膜、腹膜和心包内膜的间皮细胞。相比之下，间皮素被许多实体瘤(包括恶性间皮瘤、卵巢癌、胃癌、肺癌，和胰腺癌，以及胆管癌和三阴性乳腺癌)过度表达(ordonez ng,am j surgpathol 1993；27:1418–28.,hassan r,laszik zg,lerner m,raffeld m,postier r,brackett d.am j clin pathol 2005；124:838–45；chou j,等breast cancer restreat2012；133:799–804)。间皮素的生物学功能尚不清楚；然而，间皮素与肿瘤细胞上的血浆糖蛋白ca125结合，表明间皮素可能导致腹膜和胸膜转移(kaneko,等,2009,j biol chem284:3739-3749；rump,等,2
3、嵌合抗原受体(car)是包含以下三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序、(2)连接/跨膜基序，和(3)胞内t细胞信号传导基序(long ah,haso wm,orentasrj.lessons learned from a highly-active cd22-specific chimeric antigenreceptor.oncoimmunology.2013；2(4):e23621)。car的抗原结合基序通常由单链可变片段(single chain fragment variable，scfv)：免疫球蛋白(ig)分子的最小结合结构域形成。还已改造了可替选的抗原结合基序，例如受体配体(即，已将il-13改造成结合肿瘤表达的il-13受体)、完整免疫受体、文库来源肽和先天免疫系统效应分子(例如nkg2d)。用于car表达的可替选细胞靶标(例如nk或γ-δt细胞)也在开发之中(brown ce等clin cancerres.2012；18(8):2199–209；lehner m等plos one.2012；7(2):e31210)。关于限定最活跃的t细胞群以使用car载体进行传导、确定最佳的培养和扩增技术，以及限定car蛋白结构本身的分子细节仍然是重要的工作。
4、car的连接基序可以是相对稳定的结构域(例如igg的恒定结构域)或被设计成延伸的柔性接头。结构基序(例如来源于igg恒定结构域的那些)可以用于将scfv结合结构域延伸远离t细胞质膜表面。这对于一些其中结合结构域与肿瘤细胞表面膜特别接近的肿瘤靶标而言可以是重要的(例如对于二唾液酸神经节苷脂gd2而言；orentas等，未发表的观察结果)。迄今为止，用于car的信号传导基序通常包含cd3-ζ链，因为该核心基序是t细胞活化的关键信号。首次报道的第二代car以cd28信号传导结构域和cd28跨膜序列为特征。该基序还用于包含cd137(4-1bb)信号传导基序的第三代car(zhao y等j immunol.2009；183(9):5563–74)。随着新技术的出现，使用与抗cd3和抗cd28抗体连接的珠活化t细胞，和来自cd28的典型“信号2”的存在不再需要由car自身编码。通过使用珠活化，发现在体外测定中第三代载体并不优于第二代载体，并且在白血病的小鼠模型中其相对于第二代载体并未提供明显的益处(haso w,lee dw,shah nn,stetler-stevenson m,yuan cm,pastan ih,dimitrovds,morgan ra,fitzgerald dj,barrett dm,wayne as,mackall cl,orentas rj.anti-cd22-chimeric antigen receptors targeting b cell precursor acutelymphoblastic leukemia,blood.2013；121(7):1165–74；kochenderfer jn等.blood.2012；119(12):2709–20)。这通过为第二代cd28/cd3-ζ(lee dw等americansociety of hematology annual meeting.new orleans,la；2013年12月7日至12月10日)和cd137/cd3-ζ信号传导形式(porter dl等n engl j med.2011；365(8):725–33)的cd19特异性car的临床成功得到证实。除cd137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如ox40)也能够在car转导的t细胞中提供重要的持续信号(yvon e等clin cancer res.2009；15(18):5852–60)。同样重要的是培养car t细胞群的培养条件。
5、用于癌症的car治疗的更广泛且有效的适应中的目前挑战与有力靶标的缺乏相关。建立细胞表面抗原的结合物现今是可容易实现的，但是发现对肿瘤具有特异性同时不伤害正常组织的细胞表面抗原仍然是艰巨的挑战。赋予car表达t细胞以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含由含有SEQ ID NO.1、3、5或7的核苷酸序列编码的间皮素抗原结合结构域。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个单链可变片段。
3.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个重链可变区。
4.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域、所述至少一个胞内信号传导结构域、或其二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
5.权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所编码的接头或间隔区结构域来源于CD8或CD28的胞外结构域，并与跨膜结构域连接。
6.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中在所编码的胞外间皮素抗原结合结构域之前是编码前导肽的前导核苷酸序列。
7.权利要求6所述的分离的
8.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其任意组合。
9.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中编码所述胞外间皮素抗原结合结构域的核酸序列包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7的核酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
10.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
11.权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域相对于所述CD3ζ胞内结构域布置在C端侧。
12.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其任意组合。
13.权利要求12所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其任意组合。
14.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求1所述的分离的核酸分子编码。
15.权利要求14所述的CAR，其包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO.2、4、6或8的氨基酸序列的间皮素抗原结合结构域。
16.权利要求15所述的CAR，其中所述间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个单链可变片段。
17.权利要求15所述的CAR，其中所述间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个重链可变区。
18.权利要求15所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154，或其任意组合。
19.权利要求18所述的CAR，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求15所述的CAR，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述至少一个胞内信号传导结构域、或其二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接，所述胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO.2、4、6或8的氨基酸序列的间皮素抗原结合结构域。
21.权利要求20所述的CAR，其中所述接头或间隔区结构域来源于CD8或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
22.权利要求17所述的CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
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【技术特征摘要】
1.编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含由含有seq id no.1、3、5或7的核苷酸序列编码的间皮素抗原结合结构域。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个单链可变片段。
3.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个重链可变区。
4.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个间皮素抗原结合结构域、所述至少一个胞内信号传导结构域、或其二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
5.权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所编码的接头或间隔区结构域来源于cd8或cd28的胞外结构域，并与跨膜结构域连接。
6.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中在所编码的胞外间皮素抗原结合结构域之前是编码前导肽的前导核苷酸序列。
7.权利要求6所述的分离的核酸分子，其中所述前导核苷酸序列包含含有seq id no:9的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码seq id no:10的前导氨基酸序列。
8.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链，cd8，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137和cd154，或其任意组合。
9.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中编码所述胞外间皮素抗原结合结构域的核酸序列包含含有seq id no:1、3、5或7的核酸序列，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
10.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域还包含cd3ζ胞内结构域。
11.权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域相对于所述cd3ζ胞内结构域布置在c端侧。
12.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其任意组合。
13.权利要求12所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12和4-1bb(cd137)，或其任意组合。
14.嵌合抗原受体(car)，其由权利要求1所述的分离的核酸分子编码。
15.权利要求14所述的car，其包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2、4、6或8的氨基酸序列的间皮素抗原结合结构域。
16.权利要求15所述的car，其中所述间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个单链可变片段。
17.权利要求15所述的car，其中所述间皮素抗原结合结构域包含与间皮素结合的抗体的至少一个重链可变区。
18.权利要求15所述的car，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链，cd8，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137和cd154，或其任意组合。
19.权利要求18所述的car，其中所述cd8跨膜结构域包含seq id no:19的氨基酸序列，或与seq id no:19的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求15所述的car，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述至少一个胞内信号传导结构域、或其二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2、4、6或8的氨基酸序列的间皮素抗原结合结构域。
21.权利要求20所述的car，其中所述接头或间隔区结构域来源于cd8或cd28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
22.权利要求17所述的car，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
23.权利要求22所述的car，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd70、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、dap10、dap12，和4-1bb(cd137)，或其组合。
24.载体，其包含权利要求1所述的核酸分子。
25....
【专利技术属性】
技术研发人员：里马斯·奥伦塔什，迪娜·施奈德，博罗·德罗普利奇，迪米特尔·S·迪米特罗夫，朱中宇，
申请(专利权)人：莱蒂恩技术公司，
类型：发明
国别省市：
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