【技术实现步骤摘要】
本申请涉及癌症领域，特别地涉及ror1抗原结合结构域和包含这样的ror1抗原结合结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)及其使用方法。
技术介绍
1、癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年影响接近130万例新患者，并且其是继心血管疾病之后第二位的死亡原因，引起大约四分之一的死亡。实体瘤是这些死亡中大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面已取得显著进展，但是在过去的20年内所有癌症的总体5年存活率仅提高约10％。癌症或恶性肿瘤转移并且以不受控制的方式迅速生长，使得治疗极其困难。
2、在实体瘤和液体瘤的治疗中有许多未满足的治疗需求。ror1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1)，是一种在许多癌症类型(包括cll、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺腺癌和肉瘤(尤因肉瘤(ewing sarcoma)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤))中高表达的胚胎蛋白，且通常在正常组织中不存在(suping zhang,et al.,2012,the onco-embryonic antigen ror1 is expressed by a variety ofhuman cancers.am j pathol,181:1903-1910,ashwini balakrishnan,et al.,2017,analysis of ror1 protein expression in human cancer an
3、尽管在成人组织中普遍不存，但至少有一项报告在甲状旁腺；胰岛；以及食管、胃和十二指肠的区域中发现ror1表达(ashwini balakrishnan,et al.,2017,analysis ofror1 protein expression in human cancer and normal tissues.,clin cancer res23:3061-3071)，承认在ror1靶向抗癌治疗的临床应用中应谨慎。ror1受体包含胞质蛋白激酶结构域，根据一些报告，其参与wnt和egfr信号传导(borcherding,n.,kusner,d.et al.,2014,ror1,an embryonic protein with an emerging role in cancerbiology.protein&cell,5:496-502)。在肿瘤中，ror1可诱导上皮-间充质转化(epithelialto mesenchymal transition，emt)，并促进肿瘤增殖、侵袭和转移形成，并介导对凋亡的抗性(yamaguchi,tomoya,et al.,2012,“nkx2-1/titf1/ttf-1-induced ror1 is requiredto sustain egfr survival signaling in lung adenocarcinoma.”cancer cell 21.3:348-361；borcherding,n.,kusner,d.et al.,2014,ror1,an embryonic protein with anemerging role in cancer biology.protein&cell,5:496-502)。它在促成肿瘤表型中的作用表明它可在肿瘤的发生或发展中提供重要的功能，并因此是一种驱动蛋白。
4、较早的癌症治疗方法包括外科手术、放射治疗、化学治疗以及针对血液肿瘤的骨髓移植。然而，目前的一线治疗值得进一步改善。通过新的免疫治疗策略寻求这样的改善。已经使用多种方式开发了靶向ror 1抗原的正在进行的临床前研究和临床试验。已在鼠和非人灵长类动物二者系统中测试了表达ror1特异性car的t淋巴细胞(huang x,park h,greene j,pao j,mulvey e,zhou sx,et al.,2015,igf1r-and ror1-specific cartcells as a potential therapy for high risk sarcomas.plos one 10(7):e0133152；hudecek m,schmitt tm,baskar s,lupo-stanghellini mt,nishida t,yamamoto tn,bleakley m,turtle cj,chang wc,greisman ha,wood b,maloney dg,jensen mc,raderc,riddell sr,2010,the b-cell tumor-associated antigen ror1 can be targetedwith t cells modified to express a ror1-specific chimeric antigenreceptor.blood 116:4532-41.)。非人灵长类动物中没有毒性，这提供了可开展人研究的信心(berger,c.,et al.,2015,safety of targeting ror1 in primates with chimericantigen receptor-modified t cells.cancer immunol res 3:2016-216.)。还提出了针对ror1的未经修饰的抗体和免疫毒素连接的抗体二者以用于治疗性用途(yang,jiahui,e本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包含至少一个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO.2或8的氨基酸序列的scFv ROR1抗原结合结构域，所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述胞内信号传导结构域包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域的功能性信号传导结构域。
2.权利要求1所述的分离的CAR，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域包含由含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的scFv ROR1抗原结合结构域。
3.权利要求2所述的分离的CAR，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2所述的分离的CAR，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
5.权利要求4所述的分离的CAR，其中所述接头或所述间隔区结构域获自IgG4、CD8或CD28的胞外结构域，并且与所述跨膜结构
6.权利要求1所述的分离的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO.4,6,10或12的氨基酸序列。
7.制备细胞的方法，其包括用包含编码CAR的核酸分子的载体转导T细胞，所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO.2或8的氨基酸序列的scFv ROR1抗原结合结构域，所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述胞内信号传导结构域包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域的功能性信号传导结构域。
8.权利要求7所述的方法，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域包含由含有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的scFv ROR1抗原结合结构域。
9.权利要求7所述的方法，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
10.权利要求7所述的方法，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
11.权利要求10所述的方法，其中所述接头或所述间隔区结构域获自IgG4、CD8或CD28的胞外结构域，并且与所述跨膜结构域连接。
12.权利要求7所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO.4,6,10或12的氨基酸序列。
13.产生经RNA改造细胞群的方法，其包括将体外转录的RNA或合成RNA引入到细胞中，其中所述RNA包含编码CAR的核酸分子，所述CAR包含至少一个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO.2或8的氨基酸序列的scFv ROR1抗原结合结构域，所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域，所述胞内信号传导结构域包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域的功能性信号传导结构域。
14.权利要求13所述的方法，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域包含由含有SEQID NO:1或SEQ ID NO:7的RNA互补物的核苷酸序列编码的scFv ROR1抗原结合结构域。
15.权利要求13所述的方法，其中所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
16.权利要求13所述的方法，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
17.权利要求16所述的方法，其中所述接头或所述间隔区结构域获自IgG4、CD8或CD28的胞外结构域，并且与所述跨膜结构域连接。
18.权利要求13所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO.4,6,10或12的氨基酸序列。
19.分离的CAR，其包含SEQ ID NO.4,6,10或12的氨基酸序列。
...【技术特征摘要】
1.分离的嵌合抗原受体(car)，其包含至少一个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2或8的氨基酸序列的scfv ror1抗原结合结构域，所述跨膜结构域包含cd8跨膜结构域，所述胞内信号传导结构域包含4-1bb和cd3ζ胞内结构域的功能性信号传导结构域。
2.权利要求1所述的分离的car，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域包含由含有seq id no:1或seq id no:7的核苷酸序列编码的scfv ror1抗原结合结构域。
3.权利要求2所述的分离的car，其中所述cd8跨膜结构域包含seq id no:22的氨基酸序列或与seq id no:22的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2所述的分离的car，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域和所述胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
5.权利要求4所述的分离的car，其中所述接头或所述间隔区结构域获自igg4、cd8或cd28的胞外结构域，并且与所述跨膜结构域连接。
6.权利要求1所述的分离的car，其中所述car包含seq id no.4,6,10或12的氨基酸序列。
7.制备细胞的方法，其包括用包含编码car的核酸分子的载体转导t细胞，所述car包含至少一个胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域包含含有seq id no.2或8的氨基酸序列的scfv ror1抗原结合结构域，所述跨膜结构域包含cd8跨膜结构域，所述胞内信号传导结构域包含4-1bb和cd3ζ胞内结构域的功能性信号传导结构域。
8.权利要求7所述的方法，其中所述至少一个胞外抗原结合结构域包含由含有seq idno:1或seq id no:7的核苷酸序列编码的scfv ror1抗原结合结构域。
9.权利要求7所述的方法，其中所述cd8跨膜结构域包含seq id no:22的氨基酸序列或与seq i...
【专利技术属性】
技术研发人员：里马斯·J·奥伦塔什，迪娜·施奈德，博罗·德罗普利奇，迪米特尔·S·迪米特罗夫，朱忠玉，
申请(专利权)人：莱蒂恩技术公司，
类型：发明
国别省市：
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