【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种提高nk细胞分化效率的方法。
技术介绍
1、免疫细胞疗法在肿瘤治疗中具有重要意义。自然杀伤细胞(nature killercells，nk)作为健康人体内清除癌变细胞的主要细胞，具有显著的抗癌效果，对急性淋系白血病等血液瘤和肝癌等实体瘤具有重要意义。与目前较为成熟的嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell,car-t)相比，t细胞治疗具有严重的副反应，例如神经毒性和“细胞因子风暴”(cytokine release syndrome,crs)，患者病情凶险，预后差[schubert,m.l.,et al.,side-effect management of chimeric antigen receptor(car)t-cell therapy.ann oncol,2021.32(1):p.34-48.]。相反，nk细胞具有更高的安全性，目前临床试验尚未报道过继nk细胞治疗产生如移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease,gvhd)和crs等严重副作用[miller,j.s.,et al.,successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical nk cells in patients with cancer.blood,2005.105(8):p.3051-7.和romee,r.,et al.,cytokine-induced m
2、目前临床试验采用从健康人外周血单个核细胞分离并扩增的nk细胞，存在供体来源不足，一个捐献者提供的nk细胞只能治疗一位病人等问题，且存在个体间差异，难以做到规模化和标准化，对于评估患者预后存在较大困难[passweg,j.r.,et al.,purified donor nk-lymphocyteinfusion to consolidate engraftment after haploidentical stem cell transplantation.leukemia,2004.18(11):p.1835-8.]。以上问题对提供剂量足够且有抗肿瘤活性的nk细胞提出新的要求。而从人诱导性多能干细胞(hipsc)分化获得nk细胞，然后再通过扩增得到大量具有细胞毒性和分泌活性的nk细胞(ips-nk)，可以有效解决nk供体来源不足和细胞功能标准化问题，将有利于制定临床诊疗方案和患者预后评估。因此，开发一套利用hipscs经体外诱导获得大量nk细胞的方案，具有重要的应用价值和意义。
3、目前，国内外实验室建立的hipsc向nk细胞分化的诱导方案主要有：(1)胚体(eb)分化法；(2)骨髓基质细胞共培养分化法。上述两种分化方法都可以获得nk细胞。eb向nk细胞分化较好模拟了体内nk分化所需要的细胞和理化微环境，体外试验eb诱导的nk细胞对多种肿瘤细胞有良好的细胞毒性。但eb分化过程中产生种类复杂的细胞，不利于nk细胞的大量获得和后续临床应用。此外，eb向nk细胞分化周期长，一般hipscs需要1周诱导出eb，再经历4-5周分化得到nk细胞，且技术难度大，成本高。虽然以上两种方法都能最终分化获得nk细胞，但分化效率还是较低，从而导致nk细胞的生产成本较高。鉴于此，本专利技术提供了一种提高nk细胞分化效率的方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种提高nk细胞分化效率的方法，目的是提高nk细胞分化效率、降低生产成本。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、一种提高nk细胞分化效率的方法，包括如下步骤：
4、(1)第一阶段，分化形成中胚层：取人多能干细胞，用第一阶段诱导培养基进行诱导分化，得到中胚层，所述第一阶段诱导培养基包括hdm、bmp4、activin a、bfgf、chir99021、a8-301、iwr-1-endo；
5、(2)第二阶段，分化形成生血内皮细胞：更换第二阶段诱导培养基，培养所述中胚层，诱导得到生血内皮细胞；所述第二阶段诱导培养基包括hdm、vegf、bfgf；
6、(3)第三阶段，分化形成造血干祖细胞：更换第三阶段诱导培养基，培养所述生血内皮细胞，诱导得到悬浮的造血干祖细胞；所述第三阶段诱导培养基包括hdm、scf、tpo、il3、il6；
7、(4)第四阶段，分化形成nk细胞：更换第四阶段诱导培养基，将所述造血干祖细胞与基质细胞进行共培养，诱导产生nk细胞；所述第四阶段诱导培养基包括dmem/f12、500-4000mg/l葡萄糖、fbs、glutamaxtm-1、p/s。
8、本专利技术的有益效果是：该方法利用人多能干细胞来源的造血干祖细胞(hspc)与基质细胞共培养进行nk分化，并通过调节第四阶段诱导培养基即nk分化培养基中的葡萄糖浓度来提高nk细胞分化效率，筛选出适合nk分化的最适葡萄糖浓度，进一步提高了nk细胞分化效率，并降低了生产成本。
9、进一步，所述第一阶段诱导培养基包括hdm、38-42ng/ml bmp4、28-32ng/mlactivin a、18-22ng/ml bfgf、5-7μm chir99021、0.8-1.2μm a8-301、0.8-1.2μm iwr-1-endo；
10、所述第二阶段诱导培养基包括hdm、8-12ng/ml vegf、8-12ng/ml bfgf；
11、所述第三阶段诱导培养基包括hdm、8-12ng/ml scf、48-52ng/ml tpo、8-12ng/mlil3、48-52ng/ml il6；
12、所述第四阶段诱导培养基包括dmem/f12、1000-3000mg/l葡萄糖、8-12％fbs、0.8-1.2％ glutamaxtm-1、0.8-1.2％的p/s、0-100mg/ml ascorbic acid、0-100ng/ml il-7、0-100ng/ml il-15、0-100ng/ml flt-3l、0-100ng/ml igf-1。说明其中％，是体积百分含量，例如，8-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，
4.根据权利要求2或3所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，所述HDM包括DMEM/F12、0.9-1.1％P/S、0.9-1.1％ITS-G、68-72μg/ml维生素C。
5.根据权利要求1所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，所述人多能干细胞在进行所述第一阶段的分化形成中胚层前进行前处理；所述前处理包括以下具体步骤：先将所述人多能干细胞进行消化处理，再在含有Y-27632抑制剂的培养基中培养12-36小时。
8.根据权利要求7所述的提高NK细胞分化效率的方法，其特征在于，含有Y-27632抑制剂的培养基基包括mTeSR1和8-12μM Y-27632。<...
【技术特征摘要】
1.一种提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，
4.根据权利要求2或3所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，所述hdm包括dmem/f12、0.9-1.1％p/s、0.9-1.1％its-g、68-72μg/ml维生素c。
5.根据权利要求1所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的提高nk细胞分化效率的方法，其特征在于，所述人多能干细胞在进...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘光锦，朱艳玲，麦玉婵，
申请(专利权)人：中国科学院香港创新研究院再生医学与健康创新中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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