【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法及应用。
技术介绍
1、免疫细胞治疗在肿瘤治疗中具有重要意义，其中t细胞疗法具有显著的抗癌效果，随着该疗法的成熟，多种t细胞治疗获得美国fda批准。虽然目前t细胞治疗对血液肿瘤效果较好，但是对实体瘤疗效不佳。主要原因是实体瘤组织内的肿瘤微环境存在多种免疫抑制机制，并且t细胞在肿瘤组织停留短暂，透过性差，难以发挥作用。因此探讨其它潜在可行的可以有效对抗实体瘤的免疫细胞疗法，具有十分重要的意义。巨噬细胞(macrophage)是具有吞噬作用的单核免疫细胞，能够在实体组织驻留，对抵御病原体入侵和维持机体免疫稳态平衡具有重要作用。许多疾病如肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫病等的发生发展都伴随着巨噬细胞功能的异常，因此巨噬细胞在相关疾病的治疗中有巨大潜能。但目前我们首先需要开发出一套快速高效且可以大规模产生巨噬细胞的分化体系，以满足临床治疗对巨噬细胞数量的需求。
2、从人多能干细胞(human pluripotent stem cells，hpscs)分化为巨噬细胞具有特殊的意义，因为它为临床应用和疾病病理基础研究提供了无限的细胞来源。人多能干细胞是一类具有各谱系分化能力和无限增殖能力的细胞，主要包括人胚胎干细胞(humanembryonic stem cell，hesc)和人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stemcells，hipscs)。利用人多能干细胞分化获得巨噬细胞将有望解决巨噬细胞来源受限的难题。hpsc
3、上述三种分化方法都可以获得巨噬细胞，但是其中拟胚体(eb)分化法存在着操作繁琐及分化效率不稳定等问题，滋养层细胞共培养分化法存在依赖于异种材料(基质细胞op9是鼠源细胞)的使用，有一定的安全风险，因此有难以克服的局限性等问题；而单层分化法则相对更稳定和安全；利用单层分化法分化获得巨噬细胞，一般需要先将人多能干细胞分化为造血干/祖细胞(hspcs)，然后再将hspcs进行髓系分化，最终分化获得巨噬细胞，这种传统的单层分化方法周期较长，成本过高。鉴于此，本专利技术提供一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法及应用。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法及应用。目的是提供一套经济、稳定、高效、快速的原始巨噬细胞单层分化方法，经此方法产生的巨噬细胞可以正常表达经典巨噬细胞的表面标志物，有正常的吞噬功能和极化响应能力，并且呈现典型的巨噬细胞形态。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、第一方面，提供一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，包括如下步骤：
4、(1)第一阶段，分化形成中胚层：取人多能干细胞，采用第一阶段诱导培养基(hdm1)，诱导分化得到中胚层；所述第一阶段诱导培养基包括hdm、bmp4、activin a、bfgf、chir99021、a8-301、和iwr-1-endo；
5、(2)第二阶段，分化形成生血内皮细胞：更换第二阶段诱导培养基(hdm2)，培养所述中胚层，诱导得到生血内皮细胞；所述第二阶段诱导培养基包括hdm、vegf和bfgf；
6、(3)第三阶段，分化形成幼稚巨噬细胞：更换第三阶段诱导培养基(hdm3)，培养所述生血内皮细胞，诱导得到悬浮的幼稚巨噬细胞；所述第三阶段诱导培养基包括stempro-34 sfm、flt-3、il3和gm-csf；从第12天开始可持续产生幼稚巨噬细胞直至第30天左右，后续可每3-4天收集一次悬浮的幼稚巨噬细胞；
7、(4)第四阶段，分化形成成熟巨噬细胞：将所述幼稚巨噬细胞用第四阶段培养基(hdm4)培养，得到成熟巨噬细胞(macrophage)；第四阶段诱导培养基包括rpmi 1640和gm-csf。
8、本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种新型单层分化法来获得人多能干细胞来源的巨噬细胞，与现有单层分化法相比，该方法无需经过hspcs的分化阶段，可直接分化获得功能成熟的巨噬细胞；极大的简化了巨噬细胞分化体系，缩短了分化周期，并能显著降低生产成本；因此本专利技术提供的巨噬细胞分化方法更加安全可靠和稳定，能短时间大批量的产生功能成熟的巨噬细胞。
9、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
10、进一步，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为1-3天；
11、步骤(2)中采用所述第二阶段诱导培养基，培养所述中胚层诱导得到生血内皮细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为3-5天；
12、步骤(3)中采用所述第三阶段诱导培养基，培养所述生血内皮细胞，诱导得到幼稚巨噬细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为3-5天；
13、步骤(4)中采用所述第四阶段培养基培养得到成熟巨噬细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为4-6天。
14、进一步，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为2天；
15、步骤(2)中采用所述第二阶段诱导培养基，培养所述中胚层诱导得到生血内皮细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为4天；
16、步骤(3)中采用所述第三阶段诱导培养基，培养所述生血内皮细胞，诱导得到幼稚巨噬细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为4天；
17、步骤(4)中采用所述第四阶段培养基培养得到成熟巨噬细胞的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为5天。
18、进一步，所述第一阶段诱导培养基包括hdm、20-60ng/ml bmp4、15-45ng/mlactivin a、10-30ng/ml bfgf、3-9μm chir99021、0.5-1.5μm a8-301和0.5-1.5μm iwr-1-endo；
19、所述第二阶段诱导培养基包括hdm、20-60ng/ml vegf和25-75ng/ml bfgf；
20、所述第三阶段诱导培养基包括st本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，CO2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为1-3天；
3.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，CO2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为2天；
4.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基包括HDM、20-60ng/mL BMP4、15-45ng/mL Activin A、10-30ng/mL bFGF、3-9μM CHIR99021、0.5-1.5μMA8-301和0.5-1.5μM IWR-1-endo；
5.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基包括HDM、4
6.根据权利要求4或5所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述HDM包括DMEM/F12基础培养基、P/S、ITS-G和维生素C。
7.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中所述人多能干细胞的接种密度为15-17.5万/mL。
8.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述人多能干细胞在进行所述第一阶段的分化形成中胚层前进行前处理；所述前处理包括以下具体步骤：先将所述人多能干细胞进行消化处理，再在含有Y-27632的培养基中培养12-36小时。
9.根据权利要求8所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述消化处理采用的消化试剂为Accutase消化液，在常温下消化的时间为3-5分钟；含有Y-27632的培养基包括mTeSR1和Y-27632。
10.一种巨噬细胞的应用，其特征在于，将权利要求1至9任一项所述的方法分化得到的巨噬细胞用于巨噬细胞功能异常的疾病的治疗的药物中。
...【技术特征摘要】
1.一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为1-3天；
3.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中采用所述第一阶段诱导培养基诱导分化的条件为：温度为37±0.5℃，co2的体积分数为5％，氧含量为常氧，时间为2天；
4.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基包括hdm、20-60ng/ml bmp4、15-45ng/ml activin a、10-30ng/ml bfgf、3-9μm chir99021、0.5-1.5μma8-301和0.5-1.5μm iwr-1-endo；
5.根据权利要求1所述一种诱导人多能干细胞快速分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基包括hdm、40ng/ml bmp4、30ng/ml activin a、20ng/ml ...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，
申请(专利权)人：中国科学院香港创新研究院再生医学与健康创新中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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