无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法技术

本发明专利技术涉及在使用病毒感染体细胞的基础上利用无血清培养基对胚胎成纤维细胞进行培养进而获得更多数目的心肌细胞的方法，主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量蛋白添加剂以及小分子化合物，获得一种新型无血清培养基，以及在病毒感染胚胎成纤维细胞后使用该新型无血清培养基培养2天

【技术实现步骤摘要】
无血清培养基和提高从成纤维细胞中获得心肌细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及细胞转分化技术，具体地，本专利技术主要涉及一种利用无血清培养基提高从成纤维细胞中获得心肌细胞效率的方法
。

技术介绍

[0002]近几十年来，随着小分子药物的快速发展，其在临床上的应用越来越广泛，这使得许多严重危害人类健康的疾病能够得到更为有效的治疗，提高人均寿命的同时也增强了人们的身体素质
。
但是，仍有部分严重危害人类健康的疾病，心血管疾病便是其中一类
。
虽然人们对于以心肌细胞损伤和心脏功能受损为特点的心血管疾病的认识和治疗方式已经有了极大的进步，这使得心血管疾病死亡率整体呈现出了下降的趋势，但是由于人类成年后的心肌细胞在受损后几乎丧失其增殖能力，并且传统的治疗手段主要聚焦如何限制疤痕的形成，因此心血管类疾病仍然是世界范围内致死率最高的疾病之一
。
包括心肌梗死在内的各种导致心肌损伤的因素都会使得心肌细胞数目减少，通常伴随着残余的心肌细胞功能衰退等现象，最终引发心力衰竭
。
因此，如何促进心肌再生，如何恢复心肌组织中仍具备功能的心肌细胞数目，是改善心肌功能
、
治疗心肌梗死的重要研究方向
。
[0003]成体心肌细胞通常被认为是终末分化细胞，一般不具备增殖能力，但近年来有研究表明，人类和小鼠的成体心肌细胞每年会以极为缓慢的速度进行更新，这表明成体心肌细胞可能存在一定的增殖潜能
。
随着相关研究的不断深入，研究人员对于如何增加心肌细胞数目这一问题，存在三种主要思路；第一，刺激心肌细胞增殖，使得心肌细胞重新进入细胞周期，从而进行有丝分裂；第二，将体细胞
(
例如成纤维细胞
)
进行重编程使其直接转分化形成心肌细胞；第三，诱导各种干细胞像心肌细胞进行定向分化
。
但是，由于心肌细胞增殖能力非常弱，直接刺激心肌细胞增殖的效果并不能满足于临床治疗的需求，因此许多研究也在逐步尝试及探索其他可以增加心肌细胞数目的方法
。
[0004]当心脏发生心肌梗死后将导致心肌细胞严重缺失，心肌梗死发生后，若不进行及时救治，则会造成心肌细胞的永久性死亡，引发心脏衰竭，严重影响心脏的功能及患者的生活质量
。
虽然目前传统的治疗措施可以在一定程度上缓解病情进展，但并不能使患者恢复如初；患者出现心脏衰竭后，常伴随心肌细胞缺血坏死
、
纤维化瘢痕形成等症状，使得治疗更加困难并且易导致不良预后
。
[0005]干细胞领域的发展为人类治疗疾病提供了一条新的途径：首先将特定的细胞从人体内进行分离，随后在体外的适宜条件下将分离出的细胞进行扩增并转换为目的细胞，将其移植回体内后完成对受损的组织和器官的替换或者修复，从而达到疾病治疗的目的
(Li
等，
How far are induced pluripotent stem cells from the clinic
？
Ageing research reviews(2010)9(3):257
‑
64
；
Grabel,Prospects for pluripotent stem cell therapies:into the clinic and back to the bench.J Cell Biochem(2012)113(2):381
‑
7)。
研究者曾经计划使用胚胎干细胞
(ESCs)
体外分化获得心肌细胞，但是由于胚胎干细胞来源不足
、
面临伦理争议
、
免疫排斥以及成瘤风险等问题，这一计划离实际应用有一段
很大的距离
。2006
年建立的诱导多能干细胞技术
(iPS
技术
)
，使胚胎干细胞来源不足
、
伦理争议以及受体免疫排斥等问题在很大程度上都得以解决
(Takahashi
等，
Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell(2006)126(4):663
‑
76)。
而
2010
年心肌转分化技术的建立则可以有效规避胚胎干细胞的成瘤性风险
(Ieda
等，
Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.Cell.2010
；
142(3):375
‑
386)。
这样，以干细胞为基础的再生医学有望成为治疗心血管疾病的重要手段
。
[0006]体外获得心肌细胞主要有两种途径：
1)
利用
iPS
技术将体细胞变为多能干细胞，再通过定向分化获得心肌细胞；
2)
直接利用转分化技术从体细胞出发获得心肌细胞
。
早在
1973
年，
Eguchi
和
Okada
就提出了转分化
(transdifferentiation)
的概念，其是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象
。
此后，不同的细胞类型转换被科学家发现或者实现：胚胎成纤维细胞转换成具有收缩特性的肌细胞，在成年蝾螈四肢再生过程中，皮肤
、
肌肉和软骨细胞先转换为祖细胞，
B
淋巴细胞转换为巨噬细胞，耳蜗细胞转换成功能性的听觉细胞
(Izumikawa
等
Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.Nat Med.2005
；
11(3):271
‑
276.)。1996
年，
Naldini L
等人发现逆转录病毒载体可以整合到基因组中，且允许基因进行长期的表达，因此开发了一种基于人类免疫缺陷病毒
(HIV)
的逆转录病毒载体系统
(Naldini L,U,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.Science.1996
；
272(5259):263
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种无血清培养基，其特征在于：其由基础培养基
、
蛋白添加剂
、
小分子化合物组成和细胞培养辅助成分组成；所述蛋白添加剂包括转铁蛋白，胰岛素，碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种，所述转铁蛋白的终浓度为
5.0ng/ml
‑
50ng/ml
，所述胰岛素的终浓度为
5ng/ml
‑
30ng/ml
，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为
10ng/ml
‑
40ng/ml
；所述小分子化合物为寡霉素，所述寡霉素的终浓度为
10
μ
g/ml
‑
50
μ
g/ml。2.
根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述蛋白添加剂为转铁蛋白，胰岛素和碱性成纤维细胞生长因子，其中，所述转铁蛋白的终浓度为
5.0ng/ml
‑
20ng/ml
，所述胰岛素的终浓度为
5ng/ml
‑
20ng/ml
，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为
10ng/ml
‑
25ng/ml。3.
根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述转铁蛋白的终浓度为
5.5
±
0.1ng/ml
，所述胰岛素的终浓度为
10
±
0.5ng/ml
，和所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为
20
±
1ng/ml。4.
根据权利要求1‑3任一项所述的无血清培养基，其特征在于：所述寡霉素的终浓度为
50
±1μ
g/ml。5.
根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述细胞培养辅助成分为非必需氨基酸，
GlutaMax
，丙酮酸钠，2‑
巯基乙醇中的至少一种；优选的，所述细胞培养辅助成分为为非必需氨基酸和
GlutaMax
；更优选地，所述非必需氨基酸的体积终浓度为1％，所述
GlutaMax
的体积终浓度为1％
。6.
根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：其中所述基础培养基为
DMEM、MEM、BME、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑辉，孟斐，
申请(专利权)人：中国科学院香港创新研究院再生医学与健康创新中心有限公司，
类型：发明
国别省市：