【技术实现步骤摘要】
本公开属于生物，具体涉及一种富含表皮生长因子(egf)的外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)是一种分子量为134kd的ⅰ型跨膜糖蛋白。人类的的egf蛋白编码基因位于人第4号染色体，由1207个氨基酸组成的多肽，属于生长因子家族的典型成员。它广泛表达在人体肾、胰腺、唾腺、皮肤、甲状腺、心、胆囊等多处组织和器官，在人体的病理生理过程中扮演着极其重要的角色。egf是一个多结合位点的多效蛋白，可发挥多种生物学作用，包括具有多种生物学功能，尤其对细胞的增殖、分化和迁移作用显著，从而在器官发生发育和伤口修复中扮演重要角色。
2、近年来，egf主要在溃疡和皮肤伤口愈合领域受到越来越多的关注。当egf与受体结合后，激活下游信号通路，会产生多种生物学效应，包括：对不同来源的多种细胞，比如表皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞，均有强烈的促分裂活性，促进细胞内dna、rna和蛋白质的合成，能够加速组织的增殖与分化；促进胚胎细胞的增殖与分化，影响器官的发生发育；促进间质细胞的增殖，比如角膜内皮细胞，对角膜相关疾病具有一定的修复治疗价值。然而，egf虽然具有多种方向的治疗皮肤修复的作用，egf本身为一个多功能蛋白，分子量过大，不易吸收，制药难度大，难以用于临床治疗，因此开发一种具有靶向性治疗药物很有必要。
3、外泌体是一种细胞胞吐的纳米级细胞外囊泡(30～150nm)，属于细胞的旁分泌介质之一。外泌体可以包含rna、蛋白质和其他分子，由亲本细胞包装并发送给相连细
技术实现思路
1、本公开提供了一种富含表皮生长因子(egf)的外泌体及其制备方法。本公开通过基因编辑间充质干细胞提高其合成egf并分泌的基础能力，并通过多种方法鉴定确认了在外泌体中包裹高水平的egf，解决了外泌体中只含有极少量egf的问题。
2、本公开的一方面提供了一种外泌体，该外泌体含有含量升高的egf。
3、在一些实施方式中，所述外泌体的egf含量升高了20倍以上，例如为21倍以上、22倍以上、23倍以上、24倍以上、25倍以上、26倍以上、27倍以上、28倍以上、29倍以上、30倍以上、31倍以上、32倍以上、33倍以上、34倍以上或35倍以上。在一些具体实施方式中，所述外泌体的egf含量升高了35倍以上。
4、在一些实施方式中，所述外泌体的egf含量升高是相比于野生型间充质干细胞的外泌体的egf含量升高。
5、在一些实施方式中，所述外泌体可以由宿主细胞，例如哺乳动物细胞产生。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以由干细胞产生。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括，但不限于，人胚胎肾(hek)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ht-1080细胞、hela细胞、perc-6细胞、cevec细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(msc)细胞。在优选的实施方式中，所述宿主细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中，所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的mscs、脂肪来源的mscs、脐带血来源的mscs。
6、本公开还提供了该外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码egf的核苷酸序列导入宿主细胞中；以及，(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
7、在一些实施方式中，所述编码egf的核酸序列位于慢病毒载体中。在具体的实施方式中，所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5’ltr、3’ltr、在5’ltr和3’ltr之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列。
8、在一些实施方式中，所述egf的编码核苷酸序列为seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
9、在一些实施方式中，在步骤(1)中，使用所述慢病毒载体感染所述宿主细胞。
10、在一些实施方式中，所述3’ltr和5’ltr包括一个或多个修饰。
11、在一些实施方式中，所述5’ltr和3’ltr的u3可以被缺失或突变。
12、在一些实施方式中，所述3’ltr是缺失了u3区域的3’ltr(3’ltr-δu3)。
13、在一些实施方式中，所述5’ltr是缺失了u3区域的5’ltr(5’ltr-δu3)。
14、在一些实施方式中，所述5’ltr的启动子选自巨细胞病毒cmv启动子、劳斯肉瘤病毒rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自劳斯肉瘤病毒rsv启动子。
15、在一些实施方式中，与egf的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1a(ef1α)启动子或其转录活性片段，rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自短延伸因子1a(ef1α)启动子。
16、在一些实施方式中，egf的编码核苷酸可操作连接有ef1α启动子和kozak翻译起始序列。
17、在一些实施方式中，所述慢病毒载体还包括筛选标记物的编码核苷酸。
18、在一些实施方式中，所述筛选标记物选自荧光素酶(luciferase)、荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性标记物、氨苄抗性标记物、卡那霉素抗性标记物和新霉素抗性标记物中的一种或多种。优选地，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白(egfp)。
19、在一些实施方式中，所述慢病毒载体还包括sv40早期pa。
20、在一些实施方式中，所述慢病毒载体的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
21、在一些实施方式中，所述慢病毒载体包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节rna转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(hiv)rev应答元件(rre)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)。
22、在一些实施方式中，所述慢病毒载体还包括中央多聚嘌呤区(cppt)或中心终止序列(cts)。
23、优选地，所述cppt序列为hiv1的cppt。
24、优选地，所述cts序列为hiv1的cts。
25、在一些实施方式中，所述慢病毒载体从5’ltr区到3’ltr区依次包含：rsv启动子，5’ltr-δu3，ψ序列，rre，cppt，ef1α启动子，kozak翻译起始序列，egf的编码核苷酸，egfp，wrpe，3’ltr-δu3和sv40早期pa。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种外泌体，所述外泌体含有含量升高的表皮生长因子(EGF)，
2.权利要求1所述的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码EGF的核苷酸序列导入宿主细胞中；以及，(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述编码EGF的核酸序列位于慢病毒载体中，优选地，所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5’LTR、3’LTR、在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述EGF的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5’LTR的启动子选自巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子；和/或
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体还包括筛选标记物的编码核苷酸、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE、逆转录
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体从5’LTR区到3’LTR区依次包含：RSV启动子，5’LTR-ΔU3，Ψ序列，RRE，cPPT，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，EGF的编码核苷酸，EGFP，WRPE，3’LTR-ΔU3和SV40早期pA。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为干细胞，
9.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的外泌体或权利要求2-8任一项所述的方法制备的外泌体，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
10.权利要求1所述的外泌体、权利要求2-8任一项所述的方法制备的外泌体或权利要求9的药物组合物在制备治疗创面修复和愈合、组织修复、伤口愈合或预防疤痕增生的药物中的应用，
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体，所述外泌体含有含量升高的表皮生长因子(egf)，
2.权利要求1所述的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码egf的核苷酸序列导入宿主细胞中；以及，(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述编码egf的核酸序列位于慢病毒载体中，优选地，所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5’ltr、3’ltr、在5’ltr和3’ltr之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述egf的编码核苷酸序列为seq id no:1所示的核苷酸序列或与其具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5’ltr的启动子选自巨细胞病毒cmv启动子、劳斯肉瘤病毒rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子；和/或
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦大江，徐洪杰，董婉雯，吴迪，
申请(专利权)人：中国科学院香港创新研究院再生医学与健康创新中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。