一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用，包括以下步骤：步骤一，设备消毒杀菌；步骤二，细胞清理离心；步骤三，培养基制备；步骤四，细胞扩增；步骤五，接种培养；步骤六，切片鉴定；本发明专利技术通过在诱导培养基中加入丙酮酸钠作为抗氧化剂，加入双抗溶液作为杀菌剂，加入抗坏血酸，提升了培养基的抗氧化性

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及干细胞
，具体为一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应
。
[0003]间充质干细胞在诱导培养基的培养后可分化成骨细胞
、
脂肪细胞
、
软骨细胞，在一种间充质干细胞诱导成软骨细胞的过程中，诱导培养基中容易被杂菌感染，造成细胞污染的情况，严重的甚至时会出现坏血病
、
氧化和腐败的情况出现，大大降低了培养基的诱导培养效果，同时在培养过程中，细胞活性差
、
培养基中的渗透压高，造成细胞成活率低，不利于细胞的诱导培养，并且在培养过程中使用的器皿
、
设备上均有杂菌附着，直接用于诱导培养，大大降低了培养细胞的纯净度
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题
。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法和应用，包括以下步骤：步骤一，设备消毒杀菌；步骤二，细胞清理离心；步骤三，培养基制备；步骤四，细胞扩增；步骤五，接种培养；步骤六，切片鉴定；
[0006]其中在上述步骤一中，首先在进行细胞培养之前，对培养过程中需要用到的培养皿
、
烧杯
、
烧瓶
、
试管
、
离心管
、
滴管
、
搅拌棒等设备投入到高温蒸汽杀菌机中进行杀菌，杀菌完成后利用紫外线杀菌灯进行进一步的杀菌处理，杀菌后冷却到常温备用；
[0007]其中在上述步骤二中，当步骤一中的设备消毒完成后，对规消化之后的间充质干细胞进行计数，将计数后的细胞转移到步骤一中消毒之后的离心管中，随后在
250g
下离心3‑
4min
，吸去上清，加入预混液，进行离心沉淀物的重悬，对细胞进行清洗，随后利用离心机再次进行离心处理，进行细胞冲洗，冲洗完成后重复吸去上清，加入预混液，离心处理，进行进一步的清洗，清洗完成后备用；
[0008]其中在上述步骤三中，当步骤二中的细胞离心清洗完成后，进行培养基的制备，以基础培养基
DMEM
为基础，随后向其中加入适量的抗氧化剂
、
添加剂
、
抗坏血酸
、
双抗溶液
、
细胞生长因子
、
脯氨酸
、
地塞米松和
TGF
‑
β3，随后利用搅拌棒将各个原料充分搅拌混合，从而制成诱导培养基备用；
[0009]其中在上述步骤四中，当步骤三中的诱导培养制备完成后，将步骤二中的清洗过后的间充质干细胞投入到装有扩增培养液的烧瓶中，将烧瓶投入到培养箱中进行扩增培
养，培养箱的温度为
37℃
，培养时间为
24
‑
48h
，得到扩增后的细胞备用；
[0010]其中在上述步骤五中，当步骤四中扩增之后的细胞接种到步骤三中制备的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基放入到二氧化碳培养箱中，在合适的培养环境下进行诱导培养，培养过程中，每隔2‑
3d
更换新的诱导培养基，诱导
21
‑
25d
，诱导培养弯沉后得到软骨细胞；
[0011]其中在上述步骤六中，当步骤五中的软骨细胞培养完成后，将软骨球从培养基中取出，利用1×
BPS
清洗后，浸泡到4％的多聚甲醛溶液中，固定
30
‑
40min
，随后取出软骨球在不同梯度浓度的酒精的浸泡下进行脱水处理，脱水之后将软骨球投入到二甲苯溶液中浸泡1‑
1.5h
，浸泡完成后取出利用石蜡进行包埋，放入烤箱中处理，完成后投入到烘箱中
55℃
下烘烤
30min
，随后进行切片处理，切片后利用无水酒精和二甲苯再次进行浸泡，晾干后在切片上滴加阿利辛蓝溶液进行染色，然后完成后将切片放置到显微镜下进行染色观察，并进行图像采集和诱导评估，评估合格后即完成一种间充质干细胞诱导成软骨细胞的制备；
[0012]其中在上述步骤七中，当软骨细胞制备完成后，软骨细胞在软骨的破坏
、
缺失等多种骨科疾病中均可运用，软骨细胞与各种
3D
支架材料具有良好的生物相容性等优良特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的应用潜力
。
[0013]优选的，所述步骤一中，高温蒸汽杀菌机的温度为
90
‑
100℃
，杀菌时间为
10
‑
20min。
[0014]优选的，所述步骤二中，清洗时离心机的在
150g
下离心5‑
7min。
[0015]优选的，所述步骤三中，抗氧化剂为丙酮酸钠，添加剂为胰岛素
、
转铁蛋白
、
亚硒酸和乙醇胺混合而成
。
[0016]优选的，所述步骤三中，双抗溶液为青霉素溶液和链霉素溶液按照
1∶1
的重量份数混合而成
。
[0017]优选的，所述步骤五中，二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度为5％，
pH
为6‑
6.2
，温度为
35
‑
37℃。
[0018]本专利技术还提供一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法获得的软骨细胞的应用，间充质干细胞诱导成骨后，软骨细胞在软骨的破坏
、
缺失等多种骨科疾病中均可运用，软骨细胞与各种
3D
支架材料具有良好的生物相容性等优良特性，使得其在软骨修复应用中具有大范围的应用
。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]1.
本专利技术通过在诱导培养基中加入丙酮酸钠作为抗氧化剂，加入双抗溶液作为杀菌剂，同时加入抗坏血酸，提升了培养基的抗氧化性
、
抗腐败和抗菌的能力，减少了培养基中细菌的滋生；
[0021]2.
本专利技术通过高温蒸汽杀菌机对设备和器具进行杀菌消毒，并且高温杀菌后在利用紫外线杀菌灯进一步杀菌，减少了器具上的杂菌含量，间充质干细胞进行多次的离心冲洗，提升了细胞的纯净度，减少了培养中杂菌的出现；
[0022]3.
本专利技术通过脯氨酸的加入，调节培养过程中细胞的渗透压平衡，并且通过生成因子和添本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种间充质干细胞诱导成软骨细胞制备方法，包括以下步骤：步骤一，设备消毒杀菌；步骤二，细胞清理离心；步骤三，培养基制备；步骤四，细胞扩增；步骤五，接种培养；步骤六，切片鉴定；其特征在于：其中在上述步骤一中，首先在进行细胞培养之前，对培养过程中需要用到的培养皿
、
烧杯
、
烧瓶
、
试管
、
离心管
、
滴管
、
搅拌棒等设备投入到高温蒸汽杀菌机中进行杀菌，杀菌完成后利用紫外线杀菌灯进行进一步的杀菌处理，杀菌后冷却到常温备用；其中在上述步骤二中，当步骤一中的设备消毒完成后，对规消化之后的间充质干细胞进行计数，将计数后的细胞转移到步骤一中消毒之后的离心管中，随后在
250g
下离心3‑
4min
，吸去上清，加入预混液，进行离心沉淀物的重悬，对细胞进行清洗，随后利用离心机再次进行离心处理，进行细胞冲洗，冲洗完成后重复吸去上清，加入预混液，离心处理，进行进一步的清洗，清洗完成后备用；其中在上述步骤三中，当步骤二中的细胞离心清洗完成后，进行培养基的制备，以基础培养基
DMEM
为基础，随后向其中加入适量的抗氧化剂
、
添加剂
、
抗坏血酸
、
双抗溶液
、
细胞生长因子
、
脯氨酸
、
地塞米松和
TGF
‑
β3，随后利用搅拌棒将各个原料充分搅拌混合，从而制成诱导培养基备用；其中在上述步骤四中，当步骤三中的诱导培养制备完成后，将步骤二中的清洗过后的间充质干细胞投入到装有扩增培养液的烧瓶中，将烧瓶投入到培养箱中进行扩增培养，培养箱的温度为
37℃
，培养时间为
24
‑
48h
，得到扩增后的细胞备用；其中在上述步骤五中，当步骤四中扩增之后的细胞接种到步骤三中制备的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基放入到二氧化碳培养箱中，在合适的培养环境下进行诱导培养，培养过程中，每隔2‑
3d
更换新的诱导培养基，诱导
21
‑
25d
，诱导培养弯沉后得到软骨细胞；其中在上述步骤六中，当步骤五中的软骨细胞培养完成后，将软骨球从培养基中取出，利用1×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：易科青，罗志勇，方超，
申请(专利权)人：深圳润生元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：