一种快速高效促进成骨分化诱导液的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速高效促进干细胞成骨分化诱导液的制备方法

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效促进成骨分化诱导液的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种促成骨分化诱导液，尤其涉及一种快速高效促进干细胞成骨分化诱导液的制备方法
。

技术介绍

[0002]骨相关疾病是临床上最常见的病种之一
。
骨组织工程技术的进步为骨缺损修复提供了新的思路，可在一定程度上解决目前传统骨缺损修复所存在的缺点，如移植骨来源有限
、
疾病交叉感染风险等
。
骨修复中关键的一步就是干细胞的成骨分化过程
。
干细胞分化为成熟的骨组织需要干细胞在诱导物下分化为成骨前体细胞
、
成骨细胞
。
随后成熟的成骨细胞增殖，分泌骨基质，骨基质钙化
。
[0003]化学诱导法是目前最常用的成骨分化方法
。
通常将含有适宜浓度的地塞米松，抗坏血酸
、
维生素
D、
β
甘油磷酸钠的培养液作为干细胞的成骨诱导液
。
但该方法存在制备复杂
、
诱导效率低
、
时间长（
21
‑
28
天）
、
诱导分化成本高等问题
。
随着对干细胞分化过程的理解以及对细胞外囊泡等生化因素调控干细胞命运的研究逐步深入，现已证明外源性细胞外囊泡是调控干细胞命运的重要途经之一
。
大量研究表明干细胞成骨分化过程伴随着细胞外囊泡分泌与吞噬过程以及细胞外囊泡成分差异的变化
。
因此，通过在干细胞培养基中补充特定类型的细胞外囊泡有望实现更高效更快速的成骨分化诱导
。

技术实现思路

[0004]本专利技术涉及一种快速高效促进干细胞成骨分化诱导液的制备方法
。
所述诱导液能够快速且高效地促进干细胞向成骨分化，在骨疾病细胞实验及临床中具有较好的应用前景
。
本专利技术所述提高干细胞成骨分化效率的诱导液，其特征在于：所述诱导组合物含有培养1‑
10
天干细胞来源的
、
终浓度为1‑
10
×
109颗粒
/mL
的细胞外囊泡
。
[0005]本专利技术所述的提高干细胞成骨分化效率的诱导液最优选的配方是：在
1L
低糖
α
‑
MEM
培养基中，含有2×
109颗粒
/mL
的细胞外囊泡的溶液
。
[0006]本专利技术提供的含有特定干细胞来源细胞外囊泡的诱导液，可用于干细胞治疗骨组织再生和修复，使之能定向分化，起到调控干细胞成骨分化的功能
。
[0007]本专利技术发现，以细胞外囊泡为营养因子的促成骨分化诱导液可以快速高效地提高干细胞分化
。
附图说明
[0008]图1是实施例中特定来源干细胞细胞外囊泡的透射电镜照片，照片表明细胞外囊泡呈现双凹圆盘状
。
[0009]图2是实施例特定来源干细胞细胞外囊泡的粒径大小测定；结果显示本专利技术采用的细胞外囊泡大小介于
60
‑
100 nm
之间
。
[0010]图3是是实施例开发的成骨分化诱导液对干细胞的促成骨分化效果（
ALP
活性测
定）
。
添加本专利技术开发的成骨分化诱导液培养干细胞1天后成骨分化标志物
ALP
活性即显著上调，高于目前常用的增殖培养基（常规实验组）和成骨分化培养基（阳性实验组）
。
[0011]图4是实施例开发的成骨分化诱导液对干细胞的促成骨分化效果（茜素红染色）
。
添加本专利技术开发的成骨分化诱导液培养干细胞4天后即可看到细胞开始矿化
。
矿化程度显著高于目前常用的增殖培养基（常规实验组）和成骨分化培养基（阳性实验组）
。
实施方式
[0012]以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不以任何方式限制本专利技术
。
实施例
[0013]（1）取人骨髓间充质干细胞于含
10%
胎牛血清的
α
‑
MEM
培养基中进行培养，传代培养至第三代至第五代骨髓间充质干细胞
。
[0014]（2）取（1）中骨髓间充质干细胞，按1×
103/cm2密度接种于细胞培养瓶，添加含
10%
胎牛血清，
10mmol/L
β
‑
甘油磷酸钠
, 50mg/L
抗坏血酸和
10nmol/L
地塞米松后的培养基培养干细胞
10
天
。
[0015]（3）
PBS
洗涤细胞两次，随用更换为无血清的
α
‑
MEM
培养基孵育
48
小时
。
[0016]（4）收集（3）中的培养基
30ml
，
300 g 离心5分钟后
, 2000g
再次离心
15
分钟，再用
10000g
离心
30
分钟，获得高纯度分化干细胞来源的细胞外囊泡，随后对沉淀物用
PBS
重悬为
1ml。
[0017]（5）通过
NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)
分析其粒径，颗粒的直径约
60
‑
100 nm
，颗粒浓度为
1x10
10
颗粒
/ml。
透射电镜观察其表面形态为典型的双凹圆盘状（图 1
），符合细胞外囊泡的形态（图 2
）
。
[0018]（6）取干细胞于含
10%
胎牛血清的
α
‑
MEM
培养基中进行培养，待细胞融合度达到
80
‑ꢀ
90
％时，用
0 .25
％胰酶消化传代
。
[0019]（7）将上述步骤
(6)
传代培养得到的干细胞按5×
103个
/cm2接种至
48
孔细胞培养板上，进行成骨分化诱导
。
实验设置三组：阴性对照组组（
α
‑
MEM
培养
+10%
胎牛血清）；阳性对照组（
α
‑
MEM
培养
+10%
胎牛血清
+10mmol/L β
‑
甘油磷酸钠
, 50mg/L
抗坏血酸
+10nmol/L
地塞米松）；实验组组（
α<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种以细胞外囊泡为营养因子的促成骨分化诱导液，以
α
‑
MEM
培养基溶液为基础培养液，其特征在于：该基础培养液中含有有效浓度的细胞外囊泡；所述细胞外囊泡为特定诱导条件下获取的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡；所属细胞外囊泡的浓度为2×
109颗粒
/mL。2.
根据权利要求1所述促成骨分化诱导液，其特征在于，所述基础培养基为
α
‑
MEM
培养基
。3.
根据权利要求3所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华楠，张杨，余涛兆，杨志华，
申请(专利权)人：张杨，
类型：发明
国别省市：