用于治疗疾病的来自间充质基质细胞的细胞外囊泡制造技术

本发明专利技术涉及用于从诸如间充质基质细胞

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗疾病的来自间充质基质细胞的细胞外囊泡


[0001]本专利技术涉及用于从诸如间充质基质细胞
(MSC)
的细胞获得细胞外囊泡
(EV)
的方法，其中所述细胞在来自细胞外基质蛋白层粘连蛋白
α
‑
5、
层粘连蛋白
α
‑4或它们的功能性片段的多肽存在下或者在包含人
MCAM
蛋白的细胞外结构域的多肽存在下进行培养
。
本专利技术还涉及通过上述方法获得的细胞外囊泡
(EV)。
该
EV
可用于治疗和预防诸如炎症性疾病
、
缺血性心脏病和急性呼吸窘迫综合征等医学病况
。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡
(EV)
是由绝大多数细胞生成的脂质膜封闭的囊泡1。EV
含有蛋白质
、
核酸和脂质并且充当重要的细胞间通讯器
(
由
EV
的膜上的受体促进
1,2
)。
外泌体
、
微泡和凋亡小体代表了
EV
的主要亚型
。
外泌体在细胞内部产生，经由核内体途径释放，并且直径范围为约
30
至
100nm。
微泡从细胞质膜中出芽，范围为约
50
至
1000nm。
凋亡小体在细胞死亡过程中释放，包含细胞的各个部分，范围为约
50
至
5000nm。
[0003]由于
EV
能够在正常和病理条件下将各种分子递送到细胞中，它们对医学而言是一种有前途的工具
。
因此，
EV
可用作将各种外源分子递送至细胞内的媒介物3‑5。
此外，由若干类型的细胞
(
特别是间充质基质细胞和树突状细胞
)
产生的
EV
也作为医用药物得到测试6‑8。
[0004]间充质基质细胞
(MSC)
由以下定义：
(1)
表达某些细胞膜标志物
(CD73+、CD90+、CD105+)
；
(2)
缺失某些标志物
(CD11b
‑
、CD14
‑
、CD34
‑
、CD45
‑
、CD19
‑
、CD79a、HLA
‑
DR
‑
)
的表达；
(3)
塑料粘附力；和
(4)
体外和体内测试9中的三系发育多能性
(
分化为成骨细胞
、
软骨细胞和脂肪细胞的能力
)。MSC
可以从体内的许多组织和器官获得，如骨髓
、
华通氏胶
(Wharton
’
s jelly)、
脂肪组织
、
口腔
、
心脏和牙齿
10
。
或者，
MSC
可以从干细胞分化而来
。MSC
具有再生和免疫调节能力，因此可用于各种疾病治疗的临床前和临床试验
10
。
已经证明，
MSC
的作用至少部分具有旁分泌性质
11
，并且
MSC
产生的
EV
是主要的旁分泌因子之一
。
很难比较
MSC
及其
EV
的再生和免疫调节作用，但普遍认为与其来源的
MSC
相比，
EV
只能产生部分和较弱的作用
12
。
[0005]重要的是，
MSC
产生的
EV
的生物学效果取决于培养条件
13
。
因此，在不同细胞培养条件下体外培养的相同
MSC
产生的
EV
可能具有完全不同的特性，其生物活性可能从完全无活性到有生物活性，存在很大差异，并且应被视为不同的
EV
群体
。
找到使细胞产生具有生物活性的
EV
的体外细胞培养条件非常重要
。
[0006]活细胞应在超低温
(
液氮温度
)
储存，并且在注射到患者体内之前使用离心机和无菌层流罩进行预处理
。
绝大多数医院缺少细胞储存和预处理设备，这给
MSC
和任何其他细胞在医学中的使用带来了严重的储存和后勤问题
。
另一方面，
EV
可以使用标准冰箱储存，并在解冻后直接注射到患者体内而无需进行预处理
。
因此，具有生物活性的
EV
可以克服细胞疗法的储存和后勤问题
。
[0007]细胞外基质
(ECM)
蛋白存在于所有器官和组织的细胞之间，并且对于体内平衡和病理生理过程至关重要
14
。ECM
不仅为细胞提供机械支撑，还为细胞的正确功能和表型稳定
性提供必要的信号传导
。ECM
的病理重排与不良医疗结果之间存在强有力的临床证据，特别是在心肌梗死和心力衰竭患者中
14
。
因此，纤维状胶原
(
例如胶原
I)
的积累和基底膜胶原
(
例如胶原
IV)
的损失与心力衰竭患者的不良预后相关
14
。
预防病变器官和组织中
ECM
的病理性重排是一项重要的医学问题
。
[0008]巨噬细胞是炎症性反应的关键调节因子
。
其中，
M1
巨噬细胞促进炎症性反应，而
M2
巨噬细胞则触发炎症消退
15
。M1
和
M2
极化巨噬细胞在某些细胞因子和细胞受体的表达方面有所不同
。
因此，与
M1
巨噬细胞相比，
M2
巨噬细胞的特征在于
IL
‑
10(
抗炎细胞因子
)
与
IL
‑
12
表达水平之比显著更高，
CD
‑
206
的表达更高，并且
CD
‑
80
表达缺失
16
。
在炎症性疾病的体外试验和体内模型中，已证明
MSC
能够将
M1
表型转化为
M2
表型
17
。
[0009]器官损伤后的恢复在很大程度上依赖于成纤维细胞的激活，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于获得细胞外囊泡
(EV)
的方法，包括：
(a)
在包含至少一种选自下组的多肽的组合物存在下，在细胞培养基中，培养多能干细胞
、
多能祖细胞或内皮细胞：
(i)
包含人层粘连蛋白
α5链或其功能性变体的多肽；
(ii)
包含人层粘连蛋白
α4链或其功能性变体的多肽；和
(iii)
包含人
MCAM
的细胞外结构域或其功能性变体的多肽；和
(b)
从所述细胞培养基中分离细胞外囊泡
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞或多能祖细胞是间充质基质细胞
(MSC)。3.
根据权利要求2所述的方法，其中所述
MSC
从选自下组的来源获得：骨髓
、
华通氏胶
、
脂肪组织
、
口腔
、
心脏和牙齿
。4.
根据权利要求2所述的方法，其中所述
MSC
是由干细胞分化或由体细胞转分化的
。5.
根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述组合物用作用于细胞培养的基底并且包含至少
10
％
(w/w)
的所述至少一种多肽
。6.
根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α5链或其功能性变体的所述多肽选自下组：层粘连蛋白
‑
511、
层粘连蛋白
‑
521、
层粘连蛋白
‑
522
和层粘连蛋白
‑
523
，包括其
E8
片段
。7.
根据权利要求6所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α5链或其功能性变体的所述多肽是层粘连蛋白
‑
521
或层粘连蛋白
E8
‑
511。8.
根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α5链或其功能性变体的所述多肽选自下组：
(i)
包含如
SEQ ID NO:1
所示的层粘连蛋白
α5链氨基酸序列的多肽；
(ii)
与
SEQ ID NO:1
具有至少
60
％序列同一性的多肽；和
(iii)
包含层粘连蛋白
α5链片段的多肽，所述片段如
SEQ ID NO:1
的位置
2534
‑
3323
所示
。9.
根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α4链或其功能性变体的所述多肽选自下组：层粘连蛋白
‑
411、
层粘连蛋白
‑
421、
层粘连蛋白
‑
422
和层粘连蛋白
‑
423
，包括其
E8
片段
。10.
根据权利要求9所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α4链或其功能性变体的所述多肽是层粘连蛋白
‑
421
或层粘连蛋白
E8
‑
411。11.
根据权利要求1至
10
中任一项所述的方法，其中包含人层粘连蛋白
α4链或其功能性变体的所述多肽选自下组：
(i)
包含如
SEQ ID NO:2
所示的层粘连蛋白
α4链氨基酸序列的多肽；
(ii)
与
SEQ ID NO:2
具有至少
60
％序列同一性的多肽；和
(iii)
包含层粘连蛋白
α4链片段的多肽，所述片段如
SEQ ID NO:2
的位置
636
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：KH，
申请(专利权)人：艾乌鲁申公司，
类型：发明
国别省市：