【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备甾体激素中的应用。
技术介绍
1、甾体药物作为目前临床上用量仅次于抗生素的第二类药物，全球年产量已超过100余万吨，据2018年统计数据显示，全球甾体药物市场规模超过1200亿美元。常见的甾体药物中间体分为c19类与c22两类，其中以宝丹酮(bd)、雄甾-4-烯-3，17-二酮(ad)、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(add)、9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-oh-ad)和睾酮(ts)为主的甾体药物中间体在医药领域市场的需求逐年上升。
2、宝丹酮(bd)是雄激素合成代谢类固醇和睾丸激素(ts)衍生物，可促进蛋白质合成，支持氮潴留并刺激肾脏促红细胞生成素释放。bd通常是由雄甾-4-烯-3，17-二酮(ad)或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(add)通过化学合成制得的。然而，存在合成路线繁琐、需要添加强酸或有毒试剂、副产物多、产率低以及成本高等缺陷。与化学合成法相比，微生物转化法不仅具有合成步骤少、生产周期短、收率高、副反应少、反应条件温和、环境友好等优点，而且具有高度的立体选择性和区域选择性。目前，微生物转化法已成为甾体药物及其中间体合成路线中不可缺少的关键技术。
3、来源于brettanomyces naardenensis的17β-羟基类固醇脱氢酶可以利用雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮作为底物，催化甾体中c-17的酮基与羟基之间的相互转化，经还原反应产生17β-羟基-1,4-雄甾二烯-3-酮，即宝丹酮。
技术实现思路
1、针对现有技术中野生型17β-羟基类固醇脱氢酶酶活力低的问题，本专利技术提供了具有高酶活力的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，及其在制备甾体激素宝丹酮中的应用。本专利技术对所述的来源于brettanomyces naardenensis(gen bank id:veu22018.1)的17β-羟基类固醇脱氢酶进行定点突变，将获得的突变体编码基因通过表达载体于大肠杆菌中进行了异源表达。此外，本专利技术还将所述的突变体编码基因与过表达启动子共同连接至重组载体中，再于新金色分枝杆菌中进行异源表达，以此获得一株高产宝丹酮的基因工程菌。所述的以新金色分枝杆菌为宿主的基因工程菌可利用植物甾醇作为底物，以上述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体为催化剂制备宝丹酮，更适合工业应用，降低了宝丹酮的生产成本，提高了生产效率。
2、本专利技术提供了17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如seqid no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶经下列之一的突变所得：
3、(1)第222位天冬酰胺突变为色氨酸；
4、(2)第151位甘氨酸突变为酪氨酸；
5、(3)第212位苯丙氨酸突变为异亮氨酸。
6、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的第222位天冬酰胺突变为色氨酸所得，命名为17βhsdbnn222w。
7、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的第151位甘氨酸突变为酪氨酸所得，命名为17βhsdbng151y。
8、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体是由氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶的第212位苯丙氨酸突变为异亮氨酸所得，命名为17βhsdbnf212i。
9、本专利技术还提供了编码上述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。
10、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体17βhsdbnn222w编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
11、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体17βhsdbng151y编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
12、作为优选，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体17βhsdbnf212i编码基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。
13、本专利技术还提供了含有17β-羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体指可在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸，在本专利技术中优选载体pet28a(+)或pmv306作为重组载体的骨架。
14、本专利技术还提供了含有17β-羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因的基因工程菌。所述基因工程菌的宿主菌优为大肠杆菌或快速生长型分枝杆菌。
15、作为优选，所述快速生长型分枝杆菌选自包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌中的至少一种。进一步优选为新金色分枝杆菌mycobacteriumsp.nrrl b-3805。新金色分枝杆菌能够降解植物甾醇生产多种甾体激素药物及中间体，同时具有较好的代谢可塑性，是一种理想的甾体激素类药物的生物合成平台。微生物转化甾醇分解代谢途径一般包括：首先通过胆固醇氧化酶(chox)或3β-羟基类固醇氧化酶(3β-hsd)将胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮；侧链经催化形成末端羧基；c-27末端酰化后，胆固醇侧链被末端coa硫代酯化激活，然后c-27的羧酰基coa进入β-氧化循环途径降解甾醇的侧链，获得雄甾-4-烯-3，17-二酮(ad)，并进一步得到雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(add)。
16、基于上述的微生物转化甾醇分解代谢途径，本专利技术还提供了一种基因工程菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：
17、(1)以新金色分枝杆菌mycobacterium sp.nrrl b-3805为底盘菌，连续敲除基因ksha1、mnopccr、sala，得到菌株mn b-3805△kms；
18、(2)将权利要求5所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体编码基因与过表达启动子以及载体连接，得到重组载体；
19、(3)将步骤(2)中的重组载体转化到步骤(1)所述的菌株mn b-3805△kms中，得到所述的基因工程菌。
20、本专利技术首先对新金色分枝杆菌mycobacterium sp.nrrlb-3805的ksha1、mnopccr、sala基因进行敲除，所获得的菌株mn b-3805△kms可有效控制22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮(4-hbc)、22-羟基-23，24-双降胆甾-1，4-二烯-3-酮(1，4-hbc)、9-羟基-4-雄烯-3，17-二酮本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶经下列之一的突变所得：
2.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.编码权利要求1～4任一所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。
6.含有权利要求5所述编码基因的重组载体。
7.含有权利要求5所述编码基因的基因工程菌。
8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌或快速生长型分枝杆菌。
9.一种如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述
10.如权利要求1～4任一所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体、或如权利要求6所述的重组载体、或如权利要求7～8任一所述的基因工程菌、或如权利要求9所述的构建方法构建得到的基因工程菌在制备甾体激素中的应用。
...【技术特征摘要】
1.17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如seq id no.1所示的17β-羟基类固醇脱氢酶经下列之一的突变所得：
2.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
4.如权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：张博，朱四方，柳志强，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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