【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及亚硝酸盐还原酶突变体及其应用。
技术介绍
1、亚硝酸盐广泛存在于地下水和地表水中，造成水体亚硝酸盐污染的主要原因是过量化肥的使用，以及动物粪便、生活污水和工业废水的不合理处置等。研究表明，饮用含有亚硝酸盐的水会对人体产生毒害作用，长期饮用会导致癌症发病率的提高。目前去除废水中亚硝酸盐最普遍的方法是采用生物处理，相比化学法处理，生物法具有费用低、不产生二次污染等优势。
2、亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，nir)是从植物细胞体内提取的一种氧化还原酶，能催化亚硝酸盐还原，在细菌和古细菌中均广泛分布。野生型亚硝酸盐还原酶对于某些底物的催化活力低，稳定性较差。现有技术中通过蛋白质工程的方法，在野生型亚硝酸盐还原酶的氨基酸序列的基础上，对特定位置进行了氨基酸突变，一定程度解决了亚硝酸盐还原酶的稳定性差的问题。但是，这些亚硝酸盐还原酶突变体仍然存在制备工艺复杂、发酵时间长等问题。
3、因此需要一种同时具备酶活性高、稳定性好，且制备方法工艺简单、条件温和等优点的亚硝酸盐还原酶。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种酶活性高，稳定性好，制备工艺简单的亚硝酸盐还原酶突变体。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种亚硝酸盐还原酶突变体，在对应于seq id no:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个位置上具有氨基酸的取代。>
4、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有亚硝酸盐还原酶活性。在一些实施方式中，与野生型亚硝酸盐还原酶相比，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有增加的稳定性；其中所述的野生型亚硝酸盐还原酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
5、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第48位氨基酸可以被取代为丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或苏氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第48位氨基酸被取代为丝氨酸。
6、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第64位氨基酸可以被取代为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第64位氨基酸被取代为甘氨酸。
7、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第70位氨基酸可以被取代为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第70位氨基酸被取代为丙氨酸。
8、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第240位可以被取代为丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或苏氨酸。在优选的实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体的第240位被取代为谷氨酰胺。
9、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体可以具有seq id no:3所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列一致性的氨基酸序列。
10、在第二方面，本专利技术提供了一种编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的核酸分子。
11、在第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，其包含第二方面的核酸分子。
12、在一些实施方式中，所述表达载体可通过将上述核酸分子连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。在一些实施方式中，所述原核表达载体或真核表达载体选自pgex、pmal或pet。在一些实施方式中，所述原核表达载体为pet-28a。
13、在第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的表达载体。
14、在一些实施方式中，所述宿主细胞可以是常规用于生产上述亚硝酸盐还原酶突变体的细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以选自真菌细胞、细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞选自酵母细胞、霉菌、大肠杆菌。
15、在第五方面，本专利技术还提供了一种制备上述亚硝酸盐还原酶突变体的方法，包括发酵培养上述宿主细胞，收集和制备上述亚硝酸盐还原酶突变体。
16、在一些实施方式中，所述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备上述亚硝酸盐还原酶突变体。在一些实施方式中，所述生产罐发酵条件为do 30％以上，空气流量1∶(1～2)vvm。
17、在第六方面，本专利技术提供了一种本公开的亚硝酸盐还原酶突变体在降解亚硝酸盐中的应用。
18、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体用于污水处理。
19、在一些实施方式中，所述亚硝酸盐还原酶突变体可以用于降解污水中的亚硝酸盐。
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1.一种亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型亚硝酸盐还原酶，在对应于SEQ ID NO:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个位置上具有氨基酸的取代。
2.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于：所述亚硝酸盐还原酶突变体具有亚硝酸盐还原酶活性；优选地，与野生型亚硝酸盐还原酶相比，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有增加的稳定性。
3.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶突变体包括与SEQ ID NO:3具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。
5.一种编码亚硝酸盐还原酶突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任一项所述的亚硝酸盐还原酶突变体。
6.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，
9.权利要求1-4中任一项所述的亚硝酸盐还原酶突变体在降解亚硝酸盐中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶突变体用于污水处理。
...【技术特征摘要】
1.一种亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型亚硝酸盐还原酶，在对应于seq id no:1的第48位、第64位、第70位和第240位中的一个或多个位置上具有氨基酸的取代。
2.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于：所述亚硝酸盐还原酶突变体具有亚硝酸盐还原酶活性；优选地，与野生型亚硝酸盐还原酶相比，所述亚硝酸盐还原酶突变体具有增加的稳定性。
3.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶突变体包括与seq id no:3具有至少85％的序列一致性的氨基酸序列。
5.一种编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：方国康，汪本助，徐斌，赵亚飞，常凯丽，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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