一种多粘类芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌菌株，经鉴定命名为多粘类芽胞杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ？ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＺＪＵ０９０１，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），保藏日期为２００９年７月１９日，保藏号为ＣＣＴＣＣ？ＮＯ：Ｍ２０９１５７。本发明专利技术菌株可在离体条件下对青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用，可有效防治植物青枯病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种类芽孢杆菌，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)及其应用。
技术介绍
作物细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacear咖)(俗称青枯菌) 引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害，俗称植物瘟病。发病作物茎叶萎蔫下垂至全株 枯死，一般田块的发病率为10% _15%，重病田的发病率高达80% _99%，导致作物产量的 严重下降，甚至绝收。病原的寄主范围广泛，可侵染44个科的数百种植物，包括蕃茄、茄子、 烟草、花生、马铃薯、香蕉等。 虽然不同植物在不同环境条件下的症状和危害程度表现若干差异，但共同特点是 细菌从植株根部侵入，通过增殖和一系列生化活动损坏寄主维管束输导组织，导致植株失 水枯萎，死亡。迄今为止，通过采用抗青枯的作物品种去防治青枯病的做法是很少的，因为 已出现的品种不仅抗性低而且抗性容易丧失，其他的农业防治手段因受地域条件的限制， 也难以大面积推广。化学防治上，虽然有农用链霉素、铜制剂等药物的出现，但均不是针对 青枯病的防治农药，而且防效差，不稳定，病原菌极易产生抗药性，因此市场上尚无防治植 物青枯病的有效药剂。 目前世界上普遍认为生物防治是解决土传病害最有希望的途径之一。所以，本领 域技术人员迫切需要能够有效防治植物青枯病的新的微生物制剂和方法的出现。
技术实现思路
本专利技术提供了一种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌，该菌株可在离体条件下对 青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用。 —种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌菌株，经鉴定命名为多粘类芽胞杆菌 (Paenibacillus polymyxa) ZJU0901，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月19日，保藏号为CCTCC N0 :M 209157。 其主要形态及生物学特征如下细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动。 在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧。在培养基上的菌 落薄，呈星状扩展，菌量多而粘，表面无光泽。生长物会粘连到培养基上。生长最适温度 28-30°C ，生长温度范围为15-50°C 。生长最适pH为7. 0，生长pH范围为5. 6_8. 5。 本专利技术还提供了一种含有上述多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，制备该菌悬液 可以选用任意细菌培养基，优选采用NB培养基，其有效菌(多粘类芽胞杆菌ZJU0901)含量 优选为107 108CFU/ml，可以直接应用于防治植物青枯病。 本专利技术提供了一种无菌滤液，通过如下方法制备 取含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过 滤即为无菌滤液。 本专利技术提供了一种抗菌蛋白粗提液，通过如下方法制备 取含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过 滤得到无菌滤液，将乙醇加入无菌滤液中进行沉淀，将沉淀溶于缓冲溶液中即得抗菌蛋白 粗提液。 优选地，所述无水乙醇与菌悬液体积比为i : i，具有最大的抑菌活性。 优选地，所述缓冲溶液优选为Tris缓冲液，当然也可以选择其它缓冲溶液，只要 不会使抗菌蛋白变性即可，pH在6. 0 8. 0之间。 本专利技术还提供了多粘类芽胞杆菌ZJU0901在防治植物青枯病中的应用。 优选地，所述的植物为蕃茄、茄子、烟草、花生、马铃薯或香蕉。因为这些植物的青枯病大多由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacear咖)引起的。所述的植物最好是番茄。 本专利技术菌株可在离体条件下对青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用，可有效防治植物青枯病。附图说明 图1为本专利技术菌株不同处理下番茄青枯病的病害发生情况； 图2为本专利技术菌株不同处理下番茄青枯病的病情严重度； 图3为本专利技术菌株不同处理下土壤中青枯病菌含量的变化情况。具体实施例方式从浙江省杭州市一块青枯病严重发生的黄瓜地里采集黄瓜根际周围0-20cm的表 层土壤，装入无菌聚乙烯塑料袋中，封口 。称取土壤10g，加入装有90ml无菌水的三角瓶中 制得悬液，180r/min震荡30min，然后从所得悬液中吸取5ml加入有45ml无菌水的三角瓶 中，依次梯度稀释到第5个三角瓶为止，得到10—^10—2、10—3、10—4和10—5的稀释液。 分别取100 ii 1 10—4和10—5的稀释液涂布于营养琼脂培养基(即NA培养基，含牛 肉浸膏lg，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000ml)中，每个稀释度 重复3次，置于3(TC恒温培养箱中培养48h后，挑取培养特征相异的单个菌落，经培养纯化 后作为供试菌株。 将各型青枯病菌(见表1)接种到2『C营养琼脂液体培养基(即NB培养基，含 牛肉浸膏lg，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，水1000ml)中，180r/min培养48h， 将已灭菌融化后的NA培养基冷却到45t:左右倒入其中，摇匀后倒平板，4h后接入供试菌， 平板在室温下培养48h，观察抑菌圈的大小。 挑选抑菌圈均大于10mm的供试菌，转接至NA培养基试管斜面上，连续接种，传代 5次，挑取仍对青枯病菌有较强拮抗效力的菌株进行田间小区筛选实验。具体如下 将番茄种子播种于花盆中，每盆10粒。植株出土后，用浓度为108CFU/ml的供试 菌菌悬液按每株2ml淋1次，待番茄长至约15cm高时，用浸根法接种青枯菌T91 (浓度为 108CFU/ml)，于接种病原菌后第20d调查发病情况，选择对青枯病防效最好的一株菌株保存 于NA斜面上。 表1来自不同寄主、不同生化型的的青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌株菌抹号 寄主 生化型 注a表示不同于所有已知的青枯菌生物型 实施例2菌株鉴定 上述分离得到的菌株主要形态及生物学特征如下细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动。在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧。在培养基上的菌落薄，呈星状扩展，菌量多而粘，表面无光泽。生长物会粘连到培养基上。生长最适温度28-30°C ，生长温度范围为15-50°C 。生长最适pH为7. 0，生长pH范围5. 6_8. 5。 该菌株经FAME脂肪酸分析鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901 。 实施例3菌株ZJU0901对青枯菌的拮抗活性 本实施例仍以实施例1中8株青枯菌为指示菌株。将指示菌株的菌悬液1ml加入到15ml已灭菌融化后冷却到45t:左右的的NA培养基中，摇匀后将该培养基倒入已灭菌的培养皿上。用灭过菌的牙签挑取多粘类芽孢杆菌ZJU0901的单菌落，在带有指示菌的培养基上进行点接，培养条件为30°C ， 48h，根据抑菌圈直径大小测定其拮抗能力。拮抗结果如下(表2): 表2多粘类芽孢杆菌ZJU0901对来自不同寄主的青枯菌菌株的拮抗活性青枯菌菌抹号拮抗细菌的抑菌圓直径(mm)G7715.38 ±0.98P750.00 ± 0.00T9116.93 ±1.52E4067.35 ± 0.72E6915.52 ± 1.34T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多粘类芽胞杆菌菌株，其特征在于：命名为多粘类芽胞杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＺＪＵ０９０１，保藏号为ＣＣＴＣＣ　ＮＯ：Ｍ　２０９１５７。

【技术特征摘要】
一种多粘类芽胞杆菌菌株，其特征在于命名为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901，保藏号为CCTCC NOM 209157。2. —种含有权利要求1所述的多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液。3. 根据权利要求l所述的菌悬液，其特征在于所述的菌悬液中多粘类芽胞杆菌 ZJU0901含量为107 108CFU/ml。4. 根据权利要求1所述的菌悬液，其特征在于制备菌悬液所用的培养基为NB培养基。5. —种无菌滤液，其特征在于，通过如下方法制备取含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过滤即 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，苏婷，余山红，刘宝平，谢关林，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]