【技术实现步骤摘要】
本专利技术所属生物检测领域，特别是涉及一种实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合、试剂盒及方法。
技术介绍
1、猫嗜血支原体（candidatus mycoplasma haemominutum）又称猫附红细胞体、猫血支原体，分为三种基因型：加州型（cmhm）、俄亥俄州型（mhf）和苏黎世型（cmt）。cmhm的发病率最高，是其他两种发病率的两倍以上，隐性携带者且能加速猫白血病病毒感染相关的骨髓增生性疾病。mhf的致病性最强，感染后可能导致急性致命性溶血性贫血。cmt致病性弱，流行性低，一般不会有明显的症状，但经常与其他贫血支原体共同感染，尤其是与cmhm型，有可能增加贫血的严重程度。
2、现有技术中，对于猫嗜血支原体检测方法可进行血常规检查和血液涂片。血常规检查可表现出大细胞低色素性贫血，有相应的血细胞改变，溶血还可以出现高胆红素血症，但其他病原体也可造成该表现；血液涂片只可进行初筛，易与立克次体混淆。而基于分子生物学的普通pcr和荧光pcr在检测猫嗜血支原体的运用越来越广泛，与常规检测技术相比，此种方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速诊断提供了可靠的依据。实时定量pcr(qrt-pcr)可分为绝对定量和相对定量，绝对定量需要使用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量；而相对定量法由于具有灵敏度高、重复性好、易于操作和结果可靠等特点，应用更为广泛。使用2-δδct法计算是目前最常见的相对定量方法，该方法需要选择机体表达稳定，且与靶标扩增效率接近的内参。然而，现有的实时定量pc
3、因此，本领域亟需一种特异性检测猫嗜血支原体分型的引物探针组合、试剂盒和方法，能准确检测猫嗜血支原体cmhm、mhf和cmt三种基因型，搭配在机体表达稳定的内参，从而在猫嗜血支原体早期感染时实现对猫嗜血支原体分型的检测和定量。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合，所述猫嗜血支原体包括cmhm型、mhf型和cmt型，所述引物探针组合包括cmhm型引物探针组合、mhf型引物探针组合、cmt型引物探针组合和rps7内参基因引物探针组合，其中：
2、所述cmhm型引物探针组合包括cmhm型正向引物、cmhm型反向引物和cmhm型探针，所述cmhm型正向引物、cmhm型反向引物和cmhm型探针的核苷酸序列如下：
3、cmhm型正向引物：5’-agttgtttgtgatagatatcg-3’，如seq id no:1所示；
4、cmhm型反向引物：5’-ttggttcctcaatatatctacg-3’，如seq id no:2所示；
5、cmhm型探针：5’-ctggaattcaatgtgtagcggtgg-3’，如seq id no:3所示；
6、所述mhf型引物探针组合包括mhf型正向引物、mhf型反向引物和mhf型探针，所述mhf型正向引物、mhf型反向引物和mhf型探针的核苷酸序列如下：
7、mhf型正向引物：5’- ggaattgtcagccaagctg -3’，如seq id no:4所示；
8、mhf型反向引物：5’- tggtggaagtgaggggac -3’，如seq id no:5所示；
9、mhf型探针：5’- cgaacccccatccaattgaccag -3’，如seq id no:6所示；
10、所述cmt型引物探针组合包括cmt型正向引物、cmt型反向引物和cmt型探针，所述cmt型正向引物、cmt型反向引物和cmt型探针的核苷酸序列如下：
11、cmt型正向引物：5’- agaggcgaaggcgaaaact -3’，如seq id no:7所示；
12、cmt型反向引物：5’- ctacaacgccgaaacacaaa -3’，如seq id no:8所示；
13、cmt型探针：5’- taccccagtagtccacaccgtaaacg -3’，如seq id no:9所示；
14、所述rps7内参基因引物探针组合包括rps7内参基因正向引物、rps7内参基因反向引物和rps7内参基因探针，所述rps7内参基因正向引物、rps7内参基因反向引物和rps7内参基因探针的核苷酸序列如下：
15、rps7内参基因正向引物：5’- gtcccagaagccgcactt -3’，如seq id no:10所示；
16、rps7内参基因反向引物：5’- ctcttgcccacaatctcg -3’，如seq id no:11所示；
17、rps7内参基因探针：5’- ccgtgcacgacgcgatcctgg -3’，如seq id no:12所示。
18、具体地，所述cmhm型探针、mhf型探针、cmt型探针和rps7内参基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、vic、cy5或rox中的任意一种，所述cmhm型探针、mhf型探针、cmt型探针和rps7内参基因探针的3’端均标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3或mgb中任意一种。
19、本专利技术的第二方面，提供一种前述的实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合在制备实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的试剂盒中的应用。
20、本专利技术的第三方面，提供一种实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述试剂盒包括pcr扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述pcr试剂包括前述的实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合。
21、具体地，所述pcr扩增试剂还包括buffer mix和去离子水，所述buffer mix由dna聚合酶、mg2+和dntp组成。
22、具体地，所述阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体cmhm序列质粒、猫嗜血支原体mhf序列质粒和猫嗜血支原体cmt序列质粒的混合物。
23、本专利技术的第四方面，提供一种非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量pcr方法，所述方法基于前述的实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述方法包括步骤：
24、1）提取待测样本总dna；
25、2）制备反应体系，所述反应体系包括前述的pcr扩增试剂；
26、3）以提取的待测样本总dna为模板，同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量pcr反应；
27、4）反应结束，判定检测结果。
28、具体地，所述实时荧光定量pcr反应的程序为：
29、step1：94℃，5min；
30、step2：94℃，10s，60℃，30s；
【技术保护点】
1.一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合，其特征在于，所述猫嗜血支原体包括CMhm型、Mhf型和CMt型，所述引物探针组合包括CMhm型引物探针组合、Mhf型引物探针组合、CMt型引物探针组合和RPS7内参基因引物探针组合，其中：
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合，其特征在于，所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、CY5或ROX中的任意一种，所述CMhm型探针、Mhf型探针、CMt型探针和RPS7内参基因探针的3’端均标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
3.权利要求1或2中任一项所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的引物探针组合在制备实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒中的应用。
4.一种实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述PCR扩增试剂包括权利要求1或2中任
5. 根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括Buffer Mix和去离子水，所述Buffer Mix由DNA聚合酶、Mg2+和dNTP组成。
6.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为灭菌去离子水，所述阳性对照为猫嗜血支原体CMhm序列质粒、猫嗜血支原体Mhf序列质粒和猫嗜血支原体CMt序列质粒的混合物。
7.一种非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法基于权利要求4-6中任一项所述的实时荧光定量PCR检测猫嗜血支原体的试剂盒，所述方法包括步骤：
8.根据权利要求7所述的非诊断目的检测猫嗜血支原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：
...【技术特征摘要】
1.一种实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合，其特征在于，所述猫嗜血支原体包括cmhm型、mhf型和cmt型，所述引物探针组合包括cmhm型引物探针组合、mhf型引物探针组合、cmt型引物探针组合和rps7内参基因引物探针组合，其中：
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合，其特征在于，所述cmhm型探针、mhf型探针、cmt型探针和rps7内参基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、vic、cy5或rox中的任意一种，所述cmhm型探针、mhf型探针、cmt型探针和rps7内参基因探针的3’端均标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3或mgb中任意一种。
3.权利要求1或2中任一项所述的实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的引物探针组合在制备实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的试剂盒中的应用。
4.一种实时荧光定量pcr检测猫嗜血支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：王恩恩，
申请(专利权)人：深圳市刚竹医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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