【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及间充质干细胞应用领域，尤其涉及一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法及其应用。
技术介绍
1、脐带间充质干细胞是一种广泛存在于新生儿脐带中，来源于发育早期中胚层且具有高度自我更新和多向分化潜能的多功能干细胞。近些年来，因为脐带间充质干细胞的应用被不断开发，其作用和机理也逐渐的展示在世人面前，这其中就包括，通过采用脐带间充质干细胞的免疫调节作用治疗各种免疫性疾病并且促进组织再生。上述作用的前提是脐带间充质干细胞能够与各类免疫细胞进行相互作用；这其中免疫细胞就包括t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞。间充质干细胞与免疫细胞的直接或间接接触会促进分泌多种生长因子和免疫调节因子，在临床试验中，间充质干细胞表现出了对炎症因子的调控作用，改善了基体的炎症环境。
2、白细胞介素10(il-10)是一种多效性细胞因子，能够抑制炎症反应和细胞免疫反应。目前已有研究通过cd3和cd28激活的t细胞与间充质干细胞共培养验证了间充质干细胞对免疫细胞分泌il-10的调控作用，但并非只有特定的t细胞亚群才能合成il-10，几乎所有淋巴细胞均能合成il-10。所以仅通过t细胞不能充分验证间充质干细胞的免疫调控作用。
3、现有技术，中国专利cn108548917a提供了一种记忆性免疫细胞的细胞因子检测体系及应用，样本量控制在了0.3～0.8ml，能够有效检测il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12等
4、因此，为了填补上述空白，本申请中提供了一种脐带间充质干细胞检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，步骤至少包括：s1：脐带间充质干细胞的接种；s2：脐带间充质干细胞的去增殖处理；s3：免疫细胞复苏；s4：免疫细胞和脐带间充质干细胞的共培养；s5：细胞因子含量检测。
2、作为一种优选的方案，所述s1的具体操作为：取得适量的脐带间充质干细胞悬液，400g离心5min，去上清液，加入完全培养基重悬，取样计数并调整浓度，之后按照计数结果，接种于24孔板，每孔1ml，平行接种3孔，置于二氧化碳培养箱中，于37℃，5％ co2条件下过夜培养。
3、作为一种优选的方案，所述完全培养基为加入了fbs的rpmi-1640培养基；所述fbs的加入量为5vt％。
4、作为一种优选的方案，所述s1中，取样计数并调整浓度1×105～2×105个/ml。
5、作为一种优选的方案，所述s1中，取样计数并调整浓度1.5×105个/ml。
6、作为一种优选的方案，所述s2的具体操作为：过夜培养后取出细胞，镜下观察细胞贴壁情况；吸弃各孔培养基，每孔加入丝裂霉素c并孵育2～3h；孵育结束后轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1ml pbs洗涤，共洗涤2～4次，洗涤结束后，于培养孔中再次加入1ml完全培养基，并将24孔板放入二氧化碳培养箱中，条件为37℃，5％ co2。
7、作为一种优选的方案，所述丝裂霉素c在培养基中的浓度为5～15μg/ml。
8、作为一种优选的方案，所述丝裂霉素c在培养基中的浓度为10μg/ml。
9、作为一种优选的方案，所述s3的具体操作为：将免疫细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存的免疫细胞转移至装有完全培养基的离心管中，400g离心5min，弃去上清液，加入适量体积的完全培养基重悬免疫细胞并计数，调整浓度。
10、作为一种优选的方案，所述s3中，调整浓度4×105～5×105个/ml。
11、作为一种优选的方案，所述s3中，调整浓度4.5×105个/ml。
12、作为一种优选的方案，所述免疫细胞为pbmc和/或cd14+monocyte。
13、作为一种优选的方案，所述免疫细胞为pbmc和cd14+monocyte。
14、作为一种优选的方案，所述s4的具体操作为：设置4组细胞组进行试验，每组设置3个平行试验，各组内免疫细胞和脐带间充质干细胞各吸取1ml混合，lps终浓度为5ng/ml，各组在二氧化碳培养箱，条件为温度37℃，co2浓度5.0％，培养24～48h。
15、作为一种优选的方案，所述s4中，4组细胞组为pbmc+lps对照组，cd14+monocyte+lps对照组，pbmc+lps+uc-mscs共培养组和cd14+monocyte+lps+uc-mscs共培养组。
16、本申请中，通过对于脐带间充质干细胞和免疫细胞的共培养步骤的设置有效提高了脐带间充质干细胞对于免疫细胞活性因子分泌促进效果的同时，能够准确检测所分泌il-10因子的含量。这主要是因为，在本申请中的脐带间充质干细胞的接种和去增殖处理的过程中，特定浓度的细胞液有效避免了异源物质在培养基中的进一步生长和繁殖，从而能够有效降低其对于最终检测的负面影响，并且还能够避免其游离的异源物质对于间充质干细胞对于免疫细胞调节作用的负面影响，从而得到更准确的检测结果。
17、作为一种优选的方案，所述s5的具体操作为：在24h和48h时收集各分孔中的各组细胞，利用elisa试剂盒检测上清液中的il-10含量。
18、本专利技术第二方面提供了一种上述检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法的应用，包括该方法在脐带间充质干细胞体外调控外周血单个核细胞分泌il类细胞因子中的应用。
19、有益效果：
20、1、本申请中提供的一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其能够有效检测脐带间充质干细胞对于单核免疫细胞对于分泌il-10活性因子的影响，为现有的检测方法提供了新的方向和方法。
21、2、本申请中提供的一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其能够有效避免培养基异源物质的游离现象对于间充质干细胞对于免疫细胞的调节作用的负面影响，从而能够有效提高检测的准确性。
22、3、本申请中提供的一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其操作方法简单，比较于现有临床免疫细胞检测方法，其具有更少的所需步骤，减少了出错概率以及影响因素，减少了检测成本。
23、4、本申请中提供的一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，能够有效应证脐带间充质干细胞对于免疫细胞，尤其是体外外周血单个核细胞调控分泌il-10的关系，能够较快得到间充质干细胞的调控能力结果。
24、5、本申请中提供的一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，通过对于脐带间充质干细胞和免疫细胞的共培养步骤的设置有效提高了脐带间充质干细胞对于免疫细胞活性因子分泌促进效果的同时，能够准确检测所分泌i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：步骤至少包括：S1：脐带间充质干细胞的接种；S2：脐带间充质干细胞的去增殖处理；S3：免疫细胞复苏；S4：免疫细胞和脐带间充质干细胞的共培养；S5：细胞因子含量检测。
2.根据权利要求1所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述S1的具体操作为：取得适量的脐带间充质干细胞悬液，400g离心5min，去上清液，加入完全培养基重悬，取样计数并调整浓度，之后按照计数结果，接种于24孔板，每孔1ml，平行接种3孔，置于二氧化碳培养箱中，于37℃，5％CO2条件下过夜培养。
3.根据权利要求2所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述完全培养基为加入了FBS的RPMI-1640培养基；所述FBS的加入量为5vt％。
4.根据权利要求3所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述S1中，取样计数并调整浓度1×105～2×105个/mL。
5.根据权利要求4所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述S
6.根据权利要求5所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述丝裂霉素C在培养基中的浓度为5～15μg/mL。
7.根据权利要求6所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述S3的具体操作为：将免疫细胞的冻存管放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存的免疫细胞转移至装有完全培养基的离心管中，400g离心5min，弃去上清液，加入适量体积的完全培养基重悬免疫细胞并计数，调整浓度。
8.根据权利要求7所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述免疫细胞为PBMC和/或CD14+Monocyte。
9.根据权利要求8所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法，其特征在于：所述S4的具体操作为：设置4组细胞组进行试验，每组设置3个平行试验，各组内免疫细胞和脐带间充质干细胞各吸取1mL混合，LPS终浓度为5ng/mL，各组在二氧化碳培养箱，条件为温度37℃，CO2浓度5.0％，中培养24～48h。
10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的检测体外调控免疫细胞分泌IL-10的方法的应用，其特征在于：包括该方法在脐带间充质干细胞体外调控外周血单个核细胞分泌IL类细胞因子中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其特征在于：步骤至少包括：s1：脐带间充质干细胞的接种；s2：脐带间充质干细胞的去增殖处理；s3：免疫细胞复苏；s4：免疫细胞和脐带间充质干细胞的共培养；s5：细胞因子含量检测。
2.根据权利要求1所述的检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其特征在于：所述s1的具体操作为：取得适量的脐带间充质干细胞悬液，400g离心5min，去上清液，加入完全培养基重悬，取样计数并调整浓度，之后按照计数结果，接种于24孔板，每孔1ml，平行接种3孔，置于二氧化碳培养箱中，于37℃，5％co2条件下过夜培养。
3.根据权利要求2所述的检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其特征在于：所述完全培养基为加入了fbs的rpmi-1640培养基；所述fbs的加入量为5vt％。
4.根据权利要求3所述的检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其特征在于：所述s1中，取样计数并调整浓度1×105～2×105个/ml。
5.根据权利要求4所述的检测体外调控免疫细胞分泌il-10的方法，其特征在于：所述s2的具体操作为：过夜培养后取出细胞，镜下观察细胞贴壁情况；吸弃各孔培养基，每孔加入丝裂霉素c并孵育2～3h；孵育结束后轻柔吸弃各孔培养基，每孔加入1ml pbs洗涤，共洗涤2～4次，洗涤结束后，于培养孔中再...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，李敏，韩晴，严坤，刘克，
申请(专利权)人：华夏源上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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