一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法技术

本发明专利技术涉及体外细胞培养及细胞检测技术领域，尤其涉及IPC A61K35，更具体地，涉及一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法。本发明专利技术通过MSC细胞接种、MSC去增殖处理、冻存PBMC复苏、PBMC与MSC共培养、浆细胞检测步骤提供了一种通过间充质干细胞抑制浆细胞数量增长的方法，并通过流式细胞仪检测浆细胞的数量，以此研究体外间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的能力。为浆细胞的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法


[0001]本专利技术涉及体外细胞培养及细胞检测
，尤其涉及IPC A61K35，更具体地，涉及一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法。

技术介绍

[0002]浆细胞是由B淋巴细胞分化形成的不具有分化能力的终末细胞，又称为效应B细胞，能分泌大量的抗体参与体液免疫，从而帮助机体防御感染。
[0003]由于外界因素的影响或自身基因的改变，可能会导致浆细胞增生失调，即过渡增殖并产生大量异常抗体，表现出一系列病理和生化改变。多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮中的B细胞亚群浆细胞的异常增多。目前体外研究较多的为间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用，现有专利CN201610008841.6公开了调节性T细胞的扩增方法，与hUC
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MSCs进行共培养促进了CD4+CD25+Treg细胞的增殖。
[0004]而间充质干细胞对B淋巴细胞的作用研究甚少，且无有效准确的方法检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的效果。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术第一方面提供了一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法，包括以下步骤：
[0006]S1：MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，300～500g离心5min，弃去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整完全培养基中的细胞浓度至终浓度，接种到6孔板中，平行接种2孔，每孔2ml，置于二氧化碳培养箱中培养，培养20～24h；r/>[0007]S2：MSC去增殖处理：培养后，吸弃各孔培养基，每孔加入1.5～2.5mL的丝裂霉素C工作液，置于二氧化碳培养箱中孵育1～5h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，加入1.5～2.5mL PBS洗涤，共洗涤2～3次；洗涤结束后，于培养孔中加入2mL完全培养基，并将6孔板放入二氧化碳培养箱培养；
[0008]S3：冻存PBMC复苏：将PBMC冻存管放入36～38℃的水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存细胞转移至离心管中，离心3～7min，弃去上清，在PBMC中加入完全培养基，重悬PBMC并计数，调整PBMC浓度使之达到最终接种密度；配制刺激剂工作液；所述PBMC包含B淋巴细胞；
[0009]S4：PBMC与MSC共培养：同一培养板上设置三组细胞进行试验，即共培养组、阳性对照组、阴性对照组；
[0010](1)共培养组：将刺激剂工作液与PBMC细胞悬液、MSC混合培养；
[0011](2)阳性对照组：将刺激剂工作液与PBMC细胞悬液混合培养；
[0012](3)阴性对照组：将PBMC细胞悬液与完全培养基混合培养；
[0013]S5：浆细胞检测：
[0014](1)取培养后细胞加入流式管中，加入FcR封闭工作液，室温或2～8℃孵育10～
30min；
[0015](2)加入Live/Dead染色工作液，室温或2～8℃孵育10～30min，孵育结束后加入3～5mL染色缓冲液，离心，去上清；
[0016](3)加入抗体工作液，室温或2～8℃孵育20～60min，孵育结束后加入3～5mL染色缓冲液，离心，去上清，加入280～320μL染色缓冲液重悬细胞，最后细胞流式仪上机检测。
[0017]优选地，所述S1步骤中完全培养基为RPMI 1640培养基+10％胎牛血清、DMEM培养基+10％胎牛血清和DMEM/F12培养基+10％胎牛血清中的任意一种。
[0018]优选地，所述RPMI 1640培养基购自Gibco品牌，货号11875093。
[0019]优选地，所述DMEM培养基购自Hyclone品牌，货号为SH30243.01。
[0020]优选地，所述DMEM/F12培养基购自Gibco品牌，货号为11320033。
[0021]优选地，所述胎牛血清购自四季青品牌，货号为13011
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8611。
[0022]优选地，所述S1步骤中完全培养基中的终浓度为1.0
×
105～3.0
×
105个/mL。
[0023]优选地，所述二氧化碳培养箱中的温度为36.8～37.2℃，二氧化碳的浓度为5％。
[0024]优选地，所述的丝裂霉素C工作液的浓度为5～50μg/mL。
[0025]优选地，所述S3步骤中离心管中装有3～5mL的完全培养基。
[0026]优选地，所述S3步骤中离心管的规格为15mL。
[0027]优选地，所述S3步骤中的离心力为500g。
[0028]优选地，所述S3步骤中的完全培养基的量为3～5mL。
[0029]优选地，所述S3步骤中PBMC最终接种密度为0.5
×
106～2.0
×
106cells/mL。
[0030]优选地，所述刺激剂工作液的配制步骤为：加入PBS，使刺激剂的最终浓度为0.1～10μg/mL。
[0031]优选地，所述刺激剂为IL
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2、IL
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10、IL
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4、IL
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21、CD40L、CPG ODN 2006、CPG ODN 2395、anti
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IgM和anti
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IgG中的一种或多种；进一步优选地，为CPG ODN 2006；进一步优选地，为CPG ODN 2006。
[0032]优选地，所述CPG ODN 2006购自InvivoGen公司。
[0033]优选地，所述PBS购自InvivoGen公司，货号为70013032。
[0034]优选地，所述共培养组的具体步骤为：将刺激剂工作液与调整浓度后的PBMC细胞悬液吸到一个15ml离心管中，完全混合形成混合液；取出含有MSC的6孔板，吸弃各孔液体；将混合液加入到含有MSC的孔中，每孔混合液体积为2mL。
[0035]优选地，所述共培养组中完全混合时刺激剂工作液和PBMC细胞悬液的体积比为1：1。
[0036]优选地，所述6孔板中混合液中MSC与PBMC数量比为1：(2～20)；进一步优选地，为1：(2～10)。
[0037]优选地，所述阳性对照组的具体步骤为：将刺激剂工作液与调整浓度后的PBMC细胞悬液吸到一个15mL离心管中，使其完全混合，加入到2个空白孔中，每孔混合液体积为2mL。
[0038]优选地，所述阳性对照组中完全混合时刺激剂工作液和PBMC细胞悬液的体积比为1：1。
[0039]优选地，所述阴性对照组的具体步骤为：将调整浓度后的PBMC细胞悬液与完全培
养基完全混合，加入到2个空白孔中，每孔混合液体积为2mL。
[0040]优选地，所述阴性对照组中完全混合时PBMC细胞悬液和完全培养基的体积比为1：1。
[0041]优选地，所述S5步骤中培养后细胞为5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：MSC细胞接种：取MSC细胞悬液，300～500g离心5min，弃去上清，加入完全培养基重悬，取样计数；按照计数结果，调整完全培养基中MSC的细胞浓度至终浓度，接种到6孔板中，平行接种2孔，每孔2ml，置于二氧化碳培养箱中培养，培养20～24h；S2：MSC去增殖处理：培养后，吸弃各孔培养基，每孔加入1.5～2.5mL的丝裂霉素C工作液，置于二氧化碳培养箱中孵育1～5h；孵育结束后取出细胞，轻柔吸弃各孔培养基，加入1.5～2.5mL PBS洗涤，共洗涤2～3次；洗涤结束后，于培养孔中加入2mL完全培养基，并将6孔板放入二氧化碳培养箱培养；S3：冻存PBMC复苏：将PBMC冻存管放入36～38℃的水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存细胞转移至离心管中，离心3～7min，弃去上清，在PBMC中加入完全培养基，重悬PBMC并计数，调整PBMC浓度使之达到最终接种密度；配制刺激剂工作液；所述PBMC包含B淋巴细胞；S4：PBMC与MSC共培养：同一培养板上设置三组细胞进行试验，即共培养组、阳性对照组、阴性对照组；(1)共培养组：将刺激剂工作液与PBMC细胞悬液、MSC混合培养；(2)阳性对照组：将刺激剂工作液与PBMC细胞悬液混合培养；(3)阴性对照组：将PBMC细胞悬液与完全培养基混合培养；S5：浆细胞检测：(1)取培养后细胞加入流式管中，加入FcR封闭工作液，室温或2～8℃孵育10～30min；(2)加入Live/Dead染色工作液，室温或2～8℃孵育10～30min，孵育结束后加入3～5mL染色缓冲液，离心，去上清；(3)加入抗体工作液，室温或2～8℃孵育20～60min，孵育结束后加入3～5mL染色缓冲液，离心，去上清，加入280～320μL染色缓冲液重悬细胞，最后细胞流式仪上机检测。2.根据权利要求1所述的检测间充质干细胞抑制B细胞分化为浆细胞的方法，其特征在于，所述S1步骤中完全培养基为RPMI 1640培养基+5～20％胎牛血...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢意，严坤，韩晴，袁洪林，任方芳，
申请(专利权)人：华夏源上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：