一种淋巴细胞永生化的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种淋巴细胞永生化的构建方法，涉及生物技术领域。所述方法包括：将EBV悬液和环孢菌素A加入到外周血淋巴细胞中，混合均匀后放入培养箱中培养，即得永生化的淋巴细胞。本发明专利技术通过EBV悬液转化外周血B淋巴细胞，使之永生化，并通过环孢菌素A抑制血液中T淋巴细胞的活性，能极大的提高永生化淋巴细胞的构建成功率。同时，本发明专利技术通过探索不同稀释比例的外周血与淋巴细胞分离液的体积比，确定了最大成功率时，稀释血与淋巴细胞分离液的体积，为进一步构建淋巴细胞的永生化方法提供参考。考。

【技术实现步骤摘要】
一种淋巴细胞永生化的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种淋巴细胞永生化的构建方法。

技术介绍

[0002]永生化的细胞是一种处于正常细胞与癌细胞之间的形态,细胞能够无限增殖,并且没有恶化的表征。对永生化细胞的深入研究可帮助我们了解正常细胞与肿瘤细胞之间生理及功能的变化,以及有助于探究细胞衰老的生理机制.永生化细胞也可作为一种人类遗传资源进行收集,尤其是某些疾病特性基因,以活细胞的形式储存起来,建立永生化细胞库。
[0003]现有技术中，永生化淋巴细胞通过EB病毒感染、转染癌基因或端粒酶获得，制备成功较率低。

技术实现思路

[0004]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用以下技术方案：
[0005]一种淋巴细胞永生化的构建方法，所述方法包括：将EBV悬液和环孢菌素A加入到外周血淋巴细胞中，混合均匀后放入培养箱中培养，即得永生化的淋巴细胞。
[0006]其中，本专利技术中，所述外周血淋巴细胞的获取，包括如下步骤：无菌条件下，取人外周静脉肝素抗凝血，加入RPMI 1640母液，稀释血液，混合均匀得到稀释血，再将稀释血加入到淋巴细胞分离液上，离心，分离白细胞层，用RPMI 1640母液洗涤3次，得到外周血淋巴细胞。
[0007]进一步的，所述人外周静脉肝素抗凝血中加入的用于稀释血液的RPMI 1640母液与外周静脉肝素抗凝血的体积比为1
‑
3:1。
[0008]更进一步的，所述稀释血与所述淋巴细胞分离液的体积比为3
>‑
4:2
‑
3。
[0009]作为本专利技术的其中一个优选实施例，所述外周血淋巴细胞与所述EBV悬液和环孢菌素A的体积比为，外周血淋巴细胞：EBV悬液：环孢菌素A＝5:3:1。
[0010]进一步的，所述EBV悬液和环孢菌素A在加入到所述外周血淋巴细胞中前，所述外周血淋巴细胞放置在全培养基中重悬，所述外周血淋巴细胞与初始所述全培养基的体积比为2:1，且所述EBV悬液和环孢菌素A直接加入到含有所述外周血淋巴细胞的全培养基中。
[0011]更进一步的，构建过程中，所述全培养基根据细胞转化和聚集情况进行加液或半量换液，当永生化淋巴细胞数达到3
×
106‑6×
106/ml时，进行冻存。
[0012]优选的，所述全培养基的制备方法如下：向RPMI 1640母液中加入20％胎牛血清、l％双抗、l％L
‑
谷氨酰胺、1.5％PHA、1.6％1mol/L且pH 7.0的Hepes，混合均匀即得。
[0013]本专利技术中，将EBV悬液和环孢菌素A加入到外周血淋巴细胞中，并装于离心管中混合均匀，37℃水浴2h后，分置于96孔板分十孔培养,一周半量换液,待细胞成聚团生长时传代至24孔板,进而转至培养箱中传代培养。
[0014]进一步的，所述离心机转速为1800
‑
2200r/min，离心时间为30
‑
45min，分离白细胞
层，得到单个核细胞。
[0015]与现有技术相比，本专利技术主要具有以下有益效果：本专利技术通过EBV悬液转化外周血B淋巴细胞，使之永生化，并通过环孢菌素A抑制血液中T淋巴细胞的活性，能极大的提高永生化淋巴细胞的构建成功率。同时，本专利技术通过探索不同比例的稀释血与淋巴细胞分离液的体积比，确定了最大成功率时，稀释血与淋巴细胞分离液的体积，为进一步构建淋巴细胞的永生化方法提供参考。
具体实施方式
[0016]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0017]实施例1
[0018]全培养基的制备
[0019]向RPMI 1640母液中加入20％胎牛血清、l％双抗、l％L
‑
谷氨酰胺、1.5％PHA、1.6％1mol/L且pH7.0的Hepes，混合均匀即得。
[0020]EBV悬液的制备
[0021]复苏l株B95.8细胞株，用RPMI 1640培养基洗1次，接种于10ml含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，每隔2
‑
3d加1次液，逐渐增加培养液到所需的毫升数时，饥饿细胞4
‑
7d后，收集上清液，以70℃及37℃反复冻融3次，1800r/min离心15min，上清液经0.22μm膜过滤，分装后以70℃保存备用。
[0022]淋巴细胞永生化的构建方法，主要包括以下步骤：
[0023]外周血淋巴细胞的获取：无菌条件下，取人外周静脉肝素抗凝血，加入与人外周静脉肝素抗凝血等体积的(即人外周静脉肝素抗凝血中加入的用于稀释血液的RPMI 1640母液与外周静脉肝素抗凝血的体积比为1:1)RPMI 1640母液，稀释血液，混合均匀得到稀释血，再将稀释血加入到淋巴细胞分离液上，其中，稀释血与淋巴细胞分离液的体积比为3:2，然后离心，离心机转速为2000r/min，离心时间为30
‑
45min，分离白细胞层，得到单个核细胞，用RPMI1640母液洗涤3次，得到外周血淋巴细胞。
[0024]将EBV悬液和环孢菌素A加入到外周血淋巴细胞中，其中，外周血淋巴细胞与EBV悬液和环孢菌素A的体积比为，外周血淋巴细胞：EBV悬液：环孢菌素A＝5:3:1，并装于离心管中混合均匀后，37℃水浴2h后，分置于96孔板分十孔培养,一周半量换液,待细胞成聚团生长时传代至24孔板,进而转至37℃、5％CO2培养箱中传代培养，即得永生化的淋巴细胞。
[0025]进一步的，EBV悬液和环孢菌素A在加入到外周血淋巴细胞中前，外周血淋巴细胞放置在全培养基中重悬，外周血淋巴细胞与初始全培养基的体积比为2:1，且EBV悬液和环孢菌素A直接加入到含有外周血淋巴细胞的全培养基中。
[0026]构建过程中，全培养基根据细胞转化和聚集情况进行加液或半量换液，当永生化淋巴细胞数达到3
×
106‑6×
106/ml时，进行冻存。
[0027]实施例2
[0028]全培养基的制备
[0029]向RPMI 1640母液中加入20％胎牛血清、l％双抗、l％L
‑
谷氨酰胺、1.5％PHA、
1.6％1mol/L且pH 7.0的Hepes，混合均匀即得。
[0030]EBV悬液的制备
[0031]复苏l株B95.8细胞株，用RPMI 1640培养基洗1次，接种于10ml含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，每隔2
‑
3d加1次液，逐渐增加培养液到所需的毫升数时，饥饿细胞4—7d后，收集上清液，以70℃及37℃反复冻融3次，1800r/min离心15min，上清液经0.22μm膜过滤，分装后以70℃保存备用。
[0032]淋巴细胞永生化的构建方法，主要包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将EBV悬液和环孢菌素A加入到外周血淋巴细胞中，混合均匀后放入培养箱中培养，即得永生化的淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于：所述外周血淋巴细胞的获取，包括如下步骤：无菌条件下，取人外周静脉肝素抗凝血，加入RPMI 1640母液，稀释血液，混合均匀得到稀释血，再将稀释血加入到淋巴细胞分离液上，离心，分离白细胞层，用RPMI 1640母液洗涤3次，得到外周血淋巴细胞。3.根据权利要求2所述的淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于，所述人外周静脉肝素抗凝血中加入的用于稀释血液的RPMI 1640母液与外周静脉肝素抗凝血的体积比为1
‑
3:1。4.根据权利要求3所述的淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于，所述稀释血与所述淋巴细胞分离液的体积比为3
‑
4:2
‑
3。5.根据权利要求1所述的淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于：所述外周血淋巴细胞与所述EBV悬液和环孢菌素A的体积比为，外周血淋巴细胞：EBV悬液：环孢菌素A＝5:3:1。6.根据权利要求5所述的淋巴细胞永生化的构建方法，其特征在于：所述EBV悬液和环孢菌素A在加入到所述外周血淋巴细胞前，所述外周血淋巴细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，程亚婷，狄鹤仙，李颖，陈志毅，林宝怡，邵彤，
申请(专利权)人：武汉百翼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：