非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法及应用技术

本发明专利技术提出了一种非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法及应用。所述短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法通过多系统剪接预测分析、改进外周血RNA的逆转录体系和精准设计检测引物，降低PCR扩增产物长度，实现外周血低表达基因的PCR扩增，可有效用于检测外显子

【技术实现步骤摘要】
非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法及应用。

技术介绍

[0002]真核生物中，蛋白质和非编码RNA分子(如microRNA、cirRNA、lncRNA等)均有对应的编码基因，这些编码基因通常含有外显子和内含子。在基因表达过程中，基因先被转录为含有外显子和内含子的mRNA前体，随后通过RNA剪接去除mRNA前体中的内含子，将外显子有序连接，最终产生成熟的mRNA。
[0003]RNA剪接是真核细胞基因表达的重要生物学机制，调控RNA剪接的顺式作用元件包括：(1)内含子5
’
端的剪接供体(donor)位点GT和内含子3
’
端的剪接受体(acceptor)位点AG。(2)近邻内含子的外显子序列，即外显子5
’
端的第1个碱基和3
’
端的最后3个碱基。这两类元件共同构成了外显子内含子接头序列。除了接头序列，基因外显子和内含子区域内部存在的剪接调控元件如增强子和沉默子亦会调控基因的剪接。明确遗传病的致病基因病是实现精准医疗的前提。研究表明，众多的人类遗传病与mRNA异常剪接有直接关系：外显子内含子接头序列的突变可以导致邻近的内含子滞留或外显子缺失；基因内部突变产生新的接头序列可以导致RNA剪接异常；剪接调控元件序列突变会影响RNA剪接效率，从而影响基因表达水平。
[0004]mRNA前体的正确剪接是真核生物基因表达的关键步骤，其剪接异常将会影响基因表达量或导致功能异常。外周血是最容易获得的无创型临床检测样本，广泛应用于检测受试者体内mRNA剪接表达；但在外周血中表达水平较低的基因通常难以检出。检测外显子
‑
内含子连接处基因突变和深度内含子突变在受试者体内产生的异常mRNA转录本，为研究新发基因突变致病机制提供在体检测手段。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出一种非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法，为研究新发基因突变致病机制提供新的在体检测手段。
[0006]基于此，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法，包括如下步骤：
[0008]对于外周血中低表达的基因，根据突变位点信息，通过软件预测突变对基因剪切的影响；
[0009]根据软件预测的剪接结果，在突变位点上下游相邻的外显子上设计短扩增PCR引物；
[0010]提取血液RNA，并保存外周血的总RNA；使用逆转录试剂盒逆转录合成第一链cDNA，逆转录时加入基因特异逆转录引物；
[0011]使用短扩增PCR引物进行PCR扩增，并检测扩增产物，将PCR产物进行Sanger测序，比对序列确认是否发生异常剪接。
[0012]进一步地，所述预测突变对基因剪切的影响过程基于SpliceAI、HSF及Varseak对外显子
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内含子连接处基因突变和深度内含子突变进行剪接预测，对预测可能产生异常剪接本的突变进行后续PCR分析。
[0013]优选地，所述预测突变对基因剪切的影响包括Accepter位点被破坏情况及新Accepter位点情况。
[0014]进一步地，短扩增PCR引物包括正向扩增引物和反向扩增引物；正向扩增引物位于突变位点上游相邻外显子，反向扩增引物位于突变位点下游1～2个外显子范围内。
[0015]进一步地，所述特异逆转录引物位于短扩增PCR反向引物下游20～50bp范围内。
[0016]进一步地，所述检测扩增产物过程使用2％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物，使用商品化琼脂糖凝胶回收试剂盒回收受试者及对照样本的扩增产生的DNA条带，若有多个条带则分别切胶回收。
[0017]本专利技术还提出一种试剂盒，包含以上所述方法中涉及的短扩增PCR引物、特异逆转录引物。
[0018]本专利技术还提出以上所述方法，或以上所述试剂盒在血液外周血低表达基因的异常剪切在体验证实验中的应用。
[0019]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0020]1.本专利技术提供的所述短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法通过多系统剪接预测分析、改进外周血RNA的逆转录体系和精准设计检测引物，降低PCR扩增产物长度，实现外周血低表达基因的PCR扩增，可有效用于检测外显子
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内含子连接处基因突变和深度内含子突变在受试者体内产生的异常mRNA转录本，为研究新发基因突变致病机制提供了在体检测手段。
[0021]2.本专利技术为避免遗漏外显子跳跃事件，通过设计短扩增子PCR，结合精确的多系统剪接预测分析，得到特异性的RNA的逆转录体系和精准设计的短扩增检测引物来成功实现剪接分析。在剪切分析RT
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PCR检测中，标准RT
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PCR引物设计至少跨越7个外显子，而短扩增子引物设计仅跨越3外显子降低了PCR扩增产物长度，使RT
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PCR检测灵敏度大大提高，而且，使用DNA聚合酶进行35个循环可以扩增出目标cDNA，能检测低表达基因。
[0022]3.本专利技术基于的短扩增RT
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PCR是一种更便宜、更简单、更快捷的方法，弥补了RNA
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seq在评估低TPM(每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)基因剪接方面的不足。短扩增子RT
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PCR可以作为基于血液样本，大规模基因组诊断服务的有用辅助手段。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为本专利技术提供的COL4A4基因表达谱。
[0025]图2为本专利技术基于SpliceAI预测COL4A4基因c.193
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1G>A突变对基因剪切的影响结
果。
[0026]图3为本专利技术基于HSF预测COL4A4基因c.193
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1G>A突变对基因剪切的影响结果。
[0027]图4为本专利技术基于Varseak预测COL4A4基因c.193
‑
1G>A突变对基因剪切的影响结果。
[0028]图5为本专利技术不同测序途径对应的结果示意图，其中：A为受试者WES测序，B为短扩增引物RT
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PCR检测，C为剪切异常示意图，D为RT
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PCR产物测序。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非诊断为目的短扩增PCR检测血液中低表达基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：对于外周血中低表达的基因，根据突变位点信息，通过软件预测突变对基因剪切的影响；根据软件预测的剪接结果，在突变位点上下游相邻的外显子上设计短扩增PCR引物；提取血液RNA，并保存外周血的总RNA；使用逆转录试剂盒逆转录合成第一链cDNA，逆转录时加入基因特异逆转录引物；使用短扩增PCR引物进行PCR扩增，并检测扩增产物，将PCR产物进行Sanger测序，比对序列确认是否发生异常剪接。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预测突变对基因剪切的影响过程基于SpliceAI、HSF及Varseak对外显子
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内含子连接处基因突变和深度内含子突变进行剪接预测，对预测可能产生异常剪接本的突变进行后续PCR分析。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预测突变对基因剪切的影响包括A...

【专利技术属性】
技术研发人员：段桂芳，苏雨晴，丁国庆，高佳慧，江恒，冷润霖，
申请(专利权)人：武汉百翼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：