一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法技术

本发明专利技术涉及免疫细胞体外培养领域，尤其涉及IPC C12N5，更具体地，涉及一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法。本发明专利技术先进行PBMC解冻，再配置配置PBMC培养基和配制刺激剂工作液，然后诱导B淋巴细胞分化，采用流式细胞术检测浆细胞占总B淋巴细胞的比例。本发明专利技术在体外能有效促进B淋巴细胞分化为浆细胞。能有效促进B淋巴细胞分化为浆细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法


[0001]本专利技术涉及免疫细胞体外培养领域，尤其涉及IPC C12N5，更具体地，涉及一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法。

技术介绍

[0002]B淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，成熟的B淋巴细胞位于淋巴结，外周血中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，浆细胞合成抗体，发挥体液免疫的功能。
[0003]有研究白表明，浆细胞可以用来开发高亲和力治疗性人源单克隆抗体，同时，通过研究体外活化的方法，可以了解B淋巴细胞活化的条件和机制，从而研究新型疫苗构建和免疫生物治疗提供理论和实验基础。
[0004]现有专利CN201610711060.3公开了一种体外活化人记忆性B细胞成浆细胞的培养方法，分离外周血单核细胞，体外活化培养，得到浆细胞。但体外活化效果还有待提高。
[0005]目前体外刺激B淋巴细胞分化为浆细胞的研究较少，且其中采用的大多数刺激剂均不能有效地刺激B淋巴细胞分化为浆细胞。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术第一方面提供了一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法，包括以下步骤：
[0007]S1：PBMC解冻：将PBMC冻存管放入36～38℃的水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存细胞转移至离心管中，离心3～7min，弃去上清，得到解冻的PBMC；
[0008]S2：配置PBMC培养基和配制刺激剂工作液：在PBMC中加入完全培养基，重悬PBMC并计数，调整PBMC浓度，使6孔板中最终接种密度为0.5
×
106～2.0
×
106cells/mL；配置刺激剂工作液；
[0009]S3：诱导B淋巴细胞分化：将PBMC细胞悬液与刺激剂工作液混合接种于6孔板中，将上述准备好的细胞，放入二氧化碳培养箱培养，采用流式细胞术检测浆细胞占总B淋巴细胞的比例。
[0010]优选地，所述S1步骤中的离心管中装有3～5mL的完全培养基。
[0011]优选地，所述离心管的规格为15mL。
[0012]优选地，所述S1步骤中的离心力为500g。
[0013]优选地，所述S2步骤中的完全培养基的量为3～5mL。
[0014]优选地，所述S2步骤中完全培养基为RPMI 1640培养基+5～20％胎牛血清、DMEM培养基+5～20％胎牛血清和DMEM/F12培养基+5～20％胎牛血清中的一种；进一步优选地，为RPMI 1640培养基+10％胎牛血清、DMEM培养基+10％胎牛血清和DMEM/F12培养基+10％胎牛血清中的一种。
[0015]优选地，所述RPMI
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1640培养基购自Sigma
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Aldrich公司，货号R8758。
[0016]优选地，所述DMEM培养基购自Sigma
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Aldrich公司，货号为D5030。
[0017]优选地，所述DMEM/F12培养基购自Sigma
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Aldrich公司，货号为D6421。
[0018]优选地，所述胎牛血清购自Sigma
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Aldrich公司，货号为F8687。
[0019]优选地，所述刺激剂工作液的配制步骤为：加入蒸馏水，使刺激剂的最终浓度为0.1～10μg/mL。
[0020]优选地，所述刺激剂为IL
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2、IL
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10、IL
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4、IL
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21、CD40L、CPG ODN 2006、CPG ODN 2395、anti
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IgM和anti
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IgG中的一种或多种；进一步优选地，为CPG ODN 2006。
[0021]本专利技术中，通过选择刺激剂的种类和浓度，可以有效地诱导B淋巴细胞分化为浆细胞。本专利技术人意外发现，加入CPG ODN 2006具有较好的免疫刺激作用，能有效地在体外促进B淋巴细胞分化为浆细胞。不同含量的刺激剂对B淋巴细胞分化效果不同，控制B淋巴细胞的分化效果。
[0022]优选地，所述CPG ODN 2006购自InvivoGen公司。
[0023]优选地，所述S3步骤中PBMC细胞悬液与刺激剂工作液的体积比为1：(0.8～1.2)；进一步优选地，为1：1。
[0024]优选地，所述S3步骤中6孔板每孔培养体积为2mL。
[0025]优选地，所述二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度为5.0％，温度为37℃。
[0026]优选地，所述二氧化碳培养箱培养的时间为100～200h；进一步优选地，为120～170h。
[0027]有益效果
[0028]本专利技术中，通过改变刺激剂的种类和作用浓度，促进B淋巴细胞能在体外能分化出大量的浆细胞。通过选择合适完全培养基，提供充足的营养和基础物质，提供B淋巴细胞优良的生长和繁殖环境，从而使B淋巴细胞有足够的条件分化为浆细胞。调整PBMC接种密度、培养时间，使PBMC中的B细胞能获得足够的营养，且提高细胞生长速率。在合适的接种密度下，B淋巴细胞能快速繁殖且具有充足的营养，从而提高B淋巴细胞分化为浆细胞的含量。
附图说明
[0029]图1为实施例1所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图；
[0030]图2为实施例2所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图；
[0031]图3为实施例3所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图；
[0032]图4为对比例1所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图；
[0033]图5为对比例2所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图；
[0034]图6为对比例3所述的诱导方法诱导得到浆细胞占总B淋巴细胞比率的流式细胞图。
具体实施方式
[0035]实施例1
[0036]将PBMC冻存管放入37.0℃水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化(约2min)，将冻存细胞转移至装有5mL完全培养基的15mL离心管中，500g离心5min。弃去上清，加入4mL的RP MI 1640培养基+10％胎牛血清完全培养基，重悬PBMC并计数，调整PBMC浓度，使6孔板中最终接种密度为1.0
×
106cells/mL。配制CPG ODN 2006刺激剂工作液，加入蒸馏水使刺激剂终浓度为1μg/mL。
[0037]将PBMC细胞悬液与刺激剂工作液以1：1的体积比混合接种，6孔板每孔培养体积为2mL，将上述准备好的细胞，放入二氧化碳培养箱培养(CO2浓度设置为：5.0％，温度设置为：37.0℃)，培养150h后采用流式细胞术检测浆细胞占总B淋巴细胞的比例。流式细胞图见图1。
[0038]所述RPMI
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1640培养基购自Sigma
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Aldrich公司，货号R8758。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：PBMC解冻：将PBMC放入36～38℃的水浴锅中，轻轻摇晃至完全融化，将冻存细胞转移至离心管中，离心3～7min，弃去上清，得到解冻的PBMC；S2：配置PBMC培养基和配制刺激剂工作液：在PBMC中加入完全培养基，重悬PBMC并计数，调整PBMC浓度，使6孔板中最终接种密度为0.5
×
106～2.0
×
106cells/mL；配置刺激剂工作液；S3：诱导B淋巴细胞分化：将PBMC细胞悬液与刺激剂工作液混合接种于6孔板中，将上述准备好的细胞，放入二氧化碳培养箱培养，采用流式细胞术检测浆细胞占总B淋巴细胞的比例。2.根据权利要求1所述的诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法，其特征在于，所述S2步骤中完全培养基为RPMI 1640培养基+5～20％胎牛血清、DMEM培养基+5～20％胎牛血清和DMEM/F12培养基+5～20％胎牛血清中的一种。3.根据权利要求2所述的诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法，其特征在于，所述S2步骤中完全培养基为RPMI 1640培养基+10％胎牛血清、DMEM培养基+10％胎牛血清和DMEM/F12培养基+10％胎牛血清中的一种。4.根据权利要求1所述的诱导B淋巴细胞分化为浆细胞的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢意，严坤，韩晴，袁洪林，任方芳，
申请(专利权)人：华夏源上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：