一种采用流式细胞术检测浆细胞含量的方法技术

本发明专利技术涉及细胞检测技术领域，尤其地，涉及IPC G01N15技术领域，更具体地，涉及一种采用流式细胞术检测浆细胞含量的方法。本发明专利技术的检测步骤包括以下步骤：取刺激活化得到的浆细胞加入流式管中，加入FcR封闭工作液，孵育；再加入Live/Dead染色工作液，孵育；孵育结束后加入染色缓冲液，离心去上清；加入配制好的抗体工作液，孵育，结束后加入染色缓冲液，离心；加入染色缓冲液，重悬细胞，细胞流式仪上机检测，设置圈门策略。本发明专利技术的检测方法提供了一种稳定可靠的抗体染色方案和浆细胞群圈门策略。定可靠的抗体染色方案和浆细胞群圈门策略。

【技术实现步骤摘要】
一种采用流式细胞术检测浆细胞含量的方法


[0001]本专利技术涉及细胞检测
，尤其地，涉及IPC G01N15
，更具体地，涉及一种采用流式细胞术检测浆细胞含量的方法。

技术介绍

[0002]流式细胞术(Flow Cytometry,FC)是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。在细胞生物学中，流式细胞术的一种常见用途就是检测和定量样品中存在的细胞类型。由于不同的细胞类型在其表面上表达的蛋白不同，因此可实现细胞检测。抗体可特异性靶向这些蛋白，有效添加一个彩色标记，从而区分一种细胞类型与另一种细胞类型。
[0003]现有专利CN201710321625.1公开了小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，获取胸腺或脾脏单细胞，加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，避光染色后用流式细胞仪进行检测，分析检测结果。
[0004]现有专利CN201910405117.0公开了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，取鸡胸腺组织制备单细胞悬液，加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗避光染色后用流式细胞仪进行检测，分析检测结果。
[0005]目前，市场上有较多的方法用于检测胸腺T淋巴亚群的方法，但由于浆细胞的含量很低，缺乏一种稳定可靠的抗体染色方案和浆细胞群圈门策略来测定浆细胞含量。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术第一方面提供了一种流式细胞术检测浆细胞含量的方法，包括以下步骤：
>[0007]S1：取刺激活化得到的浆细胞加入流式管中，加入配制好的FcR封闭工作液，孵育；
[0008]S2：加入配制好的Live/Dead染色工作液，孵育；孵育结束后加入染色缓冲液，离心4～7min，去上清；
[0009]S3：加入配制好的抗体工作液，孵育，结束后加入染色缓冲液，离心4～7min，去上清；
[0010]S4：加入染色缓冲液，重悬细胞，细胞流式仪上机检测，设置圈门策略。
[0011]优选地，所述刺激活化得到的浆细胞数量为1
×
105～1
×
106个；进一步优选地，为5
×
105个。
[0012]优选地，所述刺激活化得到的浆细胞为由PBMC经刺激剂刺激活化成的浆细胞。
[0013]优选地，所述FcR封闭工作液的添加量为100～300μL。
[0014]优选地，所述S1步骤中孵育的温度为室温或2～8℃，孵育的时间为10～30min。
[0015]优选地，所述FcR封闭工作液购自Biolegend公司，型号为422302。
[0016]优选地，所述FcR封闭工作液的配制方法按说明书配制。
[0017]优选地，所述Live/Dead染色工作液的添加量为100～300μL。
[0018]优选地，所述Live/Dead染色工作液购自eBioscience公司，货号为65
‑
0865
‑
14。
[0019]优选地，所述Live/Dead染色工作液的配制方法按说明书配制。
[0020]优选地，所述S2步骤中孵育的温度为室温或2～8℃，孵育的时间为10～30min。
[0021]优选地，所述S2步骤中染色缓冲液的量为4～6mL；进一步优选地为4mL。
[0022]优选地，所述S2步骤中染色缓冲液购自BD公司，货号为554656。
[0023]优选地，所述S2步骤中离心的离心力为300～500g。
[0024]优选地，所述S5步骤中离心的离心力为300～500g，离心时间为4～7min。
[0025]优选地，所述的抗体工作液的添加量为100～300μL。
[0026]优选地，所述抗体工作液中包括CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD27、CD38、CD138抗体中的一种或多种；进一步优选地，包括CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD27、CD38、CD138抗体中的四种或多种。
[0027]优选地，所述抗体工作液的配制方法为：将所需的抗体按说明书配制稀释，混合。
[0028]优选地，所述抗体工作液中的各抗体购自Biolegend。
[0029]优选地，所述S3步骤中孵育的温度为室温或2～8℃，孵育的时间为20～60min。
[0030]优选地，所述S3步骤中的染色缓冲液未4～6mL；进一步优选地，为4mL。
[0031]优选地，所述S4步骤中染色缓冲液的添加量为200～500μL。
[0032]优选地，所述的圈门策略为CD3
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CD14
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CD19+CD38+CD138+、CD3
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CD19+CD38+CD138+、CD3
‑
CD19+CD27+CD38+CD138+中的任意一种。
[0033]本专利技术第二方面提供了一种流式细胞术检测浆细胞含量的方法的应用，可用于生物药物调控浆细胞增殖的免疫应答评价。
[0034]有益效果
[0035]本专利技术中通过选择一定数量的刺激活化的浆细胞，在保障浆细胞数量充足时，避免了检测过程中人为因素造成的误差，提高了结果的真实性和客观性。本专利技术中选择适量的FcR封闭工作液、Live/Dead染色工作液和合适的孵育时间，减少了细胞表面的非特异性结果的同时，区分了活、死细胞，提高了本专利技术检测的准确度和灵敏度。此外，本专利技术中选用不同搭配的抗体工作液，设置了特定的圈门策略，不同的抗体特异性地与浆细胞表面的抗体结合，能提高检测方法的特异性和准确性。同时，本专利技术中的检测方法操作方便，易于掌握，在评价制备促进浆细胞增殖的生物药物过程中有着重要的应用前景。
附图说明
[0036]图1为利用实施例1中的检测方法圈取的B细胞群的流式细胞图；
[0037]图2为利用实施例1中的检测方法圈取的浆细胞群的流式细胞图；
[0038]图3为利用对比例1中的检测方法圈取的浆细胞群的流式细胞图；
[0039]图4为利用对比例1中的检测方法圈取的浆细胞群的流式细胞图。
具体实施方式
[0040]实施例1
[0041]取5
×
105个经刺激活化得到的浆细胞加入流式管中，加入200μL配制好的FcR封闭工作液，25℃孵育20min；然后加入200μL配制好的Live/Dead染色工作液，25℃孵育20min，
孵育结束后加入4mL染色缓冲液，400g离心5min，去上清；加入200μL配制好的抗体工作液(含CD3、CD19、CD38、CD138抗体)，25℃孵育40min，孵育结束后加入4mL染色缓冲液，400g离心5min，去上清，加入300μL染色缓冲液重悬细胞，最后细胞流式仪上机检测，设置圈门策略为CD3
‑
CD19+CD38+CD138+。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种流式细胞术检测浆细胞含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取刺激活化得到的浆细胞加入流式管中，加入配制好的FcR封闭工作液，孵育；S2：加入配制好的Live/Dead染色工作液，孵育；孵育结束后加入染色缓冲液，离心4～7min，去上清；S3：加入配制好的抗体工作液，孵育，结束后加入染色缓冲液，离心4～7min，去上清；S4：加入染色缓冲液，重悬细胞，细胞流式仪上机检测，设置圈门策略。2.根据权利要求1所述的流式细胞术检测浆细胞含量的方法，其特征在于，所述刺激活化得到的浆细胞数量为1
×
105～1
×
106个。3.根据权利要求1所述的流式细胞术检测浆细胞含量的方法，其特征在于，所述刺激活化得到的浆细胞为由PBMC经刺激剂刺激活化成的浆细胞。4.根据权利要求1所述的流式细胞术检测浆细胞含量的方法，其特征在于，所述FcR封闭工作液的添加量为100～300μL。5.根据权利要求1所述的流式细胞术检测浆细胞含量的方法，其特征在于，所述S1步骤中孵育的温度为室温或2～8℃，孵育的时...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢意，严坤，韩晴，袁洪林，任方芳，
申请(专利权)人：华夏源上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：