一种大肠杆菌Ｋ８８的快速检测方法技术

一种大肠杆菌Ｋ８８的快速检测方法，该方法是选择标记荧光基团（ＦＡＭ）的适配体与大肠杆菌Ｋ８８结合后，适配体上的荧光信号得到捕捉；制备已知大肠杆菌Ｋ８８浓度的被测体系，在激发波长４５５ｎｍ处测量发射波长ｎｍ的荧光值，绘制标准曲线，再制备待测样品体系，根据其荧光值查对标准曲线，求得待测样品中的大肠杆菌Ｋ８８含量。本发明专利技术灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定含大肠杆菌Ｋ８８各种样品中大肠杆菌Ｋ８８含量，在环境监测及食品分析等方面具有十分重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种大肠杆菌Ｋ８８的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：　　（１）选择生化方法合成并完成荧光修饰的大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体：５’端荧光基团修饰的大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体，其基因序列是：　　５’ＦＡＭ－ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＡＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＣ－３’　　将所述大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体用灭菌的超纯水溶解，使浓度为５μＭ，－２０℃保存；使用之前，９０－９５℃处理５－１０　ｍｉｎ，置于冰上冷却至室温，使之变性；　　（２）制备已知浓度的检测体系：将１－３　ｍｌ大肠杆菌Ｋ８８　接种于２００－５００ｍｌ　ＬＢ培养基中，３５－３７℃　１８０－２００ｒｐｍ培养２６－３２ｈ后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；用灭菌的超纯水按比例稀释成１０２、１０３、１０４　、１０５　、１０６　、１０７　、１０８　、１０９ｃｆｕ／ｍｌ　８个不同浓度溶液；各浓度溶液分别取５００μｌ放于８个ＥＰ管中，６０００－８０００ｇ离心１０－２０分钟后弃上清，每个ＥＰ管中加１００－２００μｌ　磷酸缓冲液悬浮菌体；　　（３）将所述大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体与待测细菌结合：５０μｌ所述大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体分别加入步骤（２）所述８个不同浓度的大肠杆菌Ｋ８８溶液中吸打混匀，再加入磷酸缓冲液使终体积为５００μｌ，３７℃孵育１－２ｈ后６０００－８０００ｇ离心１０－２０ｍｉｎ，弃上清；再分别加入５００－１０００μｌ　ＰＢＳ　吸打混匀，　８０００ｇ离心　１０ｍｉｎ　弃上清；重复３次，结合了大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体的菌体沉淀悬浮于５００μｌ　磷酸缓冲液中待用；　　（４）用大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体检测大肠杆菌Ｋ８８，　测定荧光值，绘制标准曲线：分别将所述８个ＥＰ管中的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定４５０ｎｍ激发波长时５２０ｎｍ发射波长的荧光值；根据大肠杆菌Ｋ８８浓度的对数值相应的荧光值绘制标准曲线；　　（５）制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值：取５００－１０００μｌ样品６０００－８０００ｇ离心１０－２０　ｍｉｎ，弃上清；沉淀悬浮于１００－２００μｌ　ＰＢＳ中，加入５０μｌ大肠杆菌Ｋ８８菌毛蛋白适配体至终体积５００μｌ；再加入磷酸缓冲液使终体积为５００μｌ，３７℃孵育１－２ｈ后６０００－８０００ｇ，离心１０－２０ｍｉｎ，弃上清；再加入５００－１００...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓乐，李华，丁兴华，彭智辉，
申请(专利权)人：邓乐，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]