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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程,具体涉及高产棘白霉素b的基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、阿尼芬净是丝状真菌来源的脂肽类抗真菌药物,2007年由辉瑞公司在欧洲和美国上市销售,年销售额达1.33亿美元(2019)。该类棘白霉素类药物能够非竞争性抑制β-1,3-葡萄糖合成酶,阻碍病原真菌细胞壁的合成,起到抑制真菌生长的作用。近年来,由新型冠状病毒感染并发、继发的侵袭性真菌感染病例激增,导致阿尼芬净等抗真菌类药物市场高速增长,全球市场供不应求。然而,阿尼芬净生产过程包含发酵生产前体棘白霉素b(ecb)和化学后修饰两步复杂工艺,临床使用价格居高不下。目前,生产菌株优化仍然以诱变育种为主。由于诱变菌种发酵产量不稳定、副产物众多,导致原料药生产价格高,制约了阿尼芬净的大规模生产和临床应用。
技术实现思路
1、为了解决现有技术以上问题,本专利技术提供了高产棘白霉素b的基因工程菌及其应用。
2、aspergillus nidulans atcc58396和aspergillus pachycristatus atcc58397是ecb生产的常用生产菌株。专利技术人发现,两株菌的ecb合成基因簇中含有两个编码蛋白高度相似(序列一致性84.63%)、功能未知的蛋白anij(genbank:amm63165.1,菌株atcc58396)和ecdj(genbank:aft91381.1,菌株atcc58397)。本专利技术发现在atcc58396中过表达anij和在atcc58397中过表达ecdj
3、作为本专利技术的一个方面,在于提供一种高产棘白霉素b的基因工程菌,该基因工程菌可过表达anij基因或过表达ecdj基因,
4、所述anij基因的编码蛋白选自:
5、(a)genbank登录号amm63165.1中的氨基酸序列组成的蛋白;
6、(b)将genbank登录号amm63165.1中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与genbank登录号amm63165.1相同活性的衍生的蛋白质;
7、或(c)其它基因编码的与genbank登录号amm63165.1所示的氨基酸序列组成具有相似性达到80%以上的蛋白;
8、所述ecdj基因的编码蛋白选自:
9、(a)genbank登录号aft91381.1中的氨基酸序列组成的蛋白;
10、(b)将genbank登录号aft91381.1中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与genbank登录号aft91381.1相同活性的衍生的蛋白质;
11、或(c)其它基因编码的与genbank登录号aft91381.1所示的氨基酸序列组成具有相似性达到80%以上的蛋白。
12、优选的,所述基因工程菌的出发菌为曲霉菌。
13、本专利技术的实施例中,所述曲霉菌选自aspergillus nidulans atcc58396或aspergillus pachycristatus atcc58397。
14、作为本专利技术的另一个方面,在于提供一种基因工程菌的构建方法,在aspergillusnidulans atcc58396中利用同源重组的方法,使用草铵膦抗性基因bar作为筛选基因,使用构巢曲霉强启动子过表达该菌株棘白霉素b生物合成基因簇中的基因anij,得到重组菌。
15、在本专利技术的实施例中,将anij基因起始密码子atg上游一段dna序列作为同源重组片段1,将anij基因起始密码子atg下游一段dna作为同源重组片段2;以5’-3’顺序,将同源重组片段1、草铵膦抗性基因bar、启动子ptef1和同源重组片段2通过融合pcr的方式,组装成一条dna片段,作为转化片段;将这一转化片段转化进入aspergillus nidulansatcc58396,得到工程菌株aspergillus nidulans joe。
16、所述草铵膦抗性基因bar以seq id no.1所示;
17、所述启动子ptef1基因以seq id no.2所示;
18、所述同源重组片段1基因以seq id no.3所示;
19、所述同源重组片段2基因以seq id no.4所示。
20、作为本专利技术的另一个方面,在于提供一种基因工程菌的构建方法,在aspergilluspachycristatus atcc58397中利用同源重组的方法,使用草铵膦抗性基因bar作为筛选基因,使用构巢曲霉强启动子过表达aspergillus pachycristatus atcc58397菌株棘白霉素b生物合成基因簇中的基因ecdj,得到重组菌。
21、在本专利技术的实施例中,将ecdj基因起始密码子atg上游一段dna序列作为同源重组片段3,将ecdj基因起始密码子atg下游一段作为同源重组片段4;以5’-3’顺序,将同源重组片段3、抗性基因bar、启动子ptef1和同源重组片段4通过融合pcr的方式,组装成一条dna片段,作为转化片段。将这一转化片段转化进入aspergillus pachycristatus atcc58397菌株,得到工程菌株aspergillus pachycristatus joe;
22、所述草铵膦抗性基因bar以seq id no.1所示;
23、所述启动子ptef1基因以seq id no.2所示;
24、所述同源重组片段3基因以seq id no.5所示;
25、所述同源重组片段4基因以seq id no.6所示。
26、具体的,所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤:
27、步骤1,anij或ecdj过表达基因元件的构建;
28、优选的,将扩增得到的anij基因起始密码子上游的同源重组片段1、草铵膦抗性基因bar、ptef1启动子和anij基因起始密码子下游的同源重组片段2通过融合pcr融合成一条双链dna,并用胶回收的方法纯化所得dna片段;
29、或者,将扩增得到的ecdj基因起始密码子上游的同源重组片段3、草铵膦抗性基因bar、ptef1启动子和ecdj基因起始密码子下游的同源重组片段4通过融合pcr融合成一条双链dna,并用胶回收的方法纯化所得dna片段。
30、步骤2,anij过表达基因元件的原生质体转化:
31、出发菌株经孢子培养和萌发后,制备原生质体;
32、将步骤1获得的dna片段加入原生质体中,得到dna和细胞混合物,进行真菌转化;
33、再经pcr筛选阳性菌落。
34、进一步的,所述构建方法还包括基因工程菌的培养与发酵。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高产棘白霉素B的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌过表达aniJ基因或过表达ecdJ基因,
2.根据权利要求1所述的高产棘白霉素B的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的出发菌为曲霉菌。
3.根据权利要求2所述的高产棘白霉素B的基因工程菌,其特征在于,所述曲霉菌选自Aspergillus nidulans ATCC58396或Aspergillus pachycristatus ATCC58397。
4.一种基因工程菌的构建方法,其特征在于,在Aspergillus nidulans ATCC58396中利用同源重组的方法,使用草铵膦抗性基因bar作为筛选基因,使用构巢曲霉强启动子过表达Aspergillus nidulans ATCC58396菌株棘白霉素B生物合成基因簇中的基因aniJ,得到重组菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法,其特征在于,将aniJ基因起始密码子ATG上游一段DNA序列作为同源重组片段1,将aniJ基因起始密码子ATG下游一段DNA作为同源重组片段2;以5’-3’顺序,将同源重组片段
6.一种基因工程菌的构建方法,其特征在于,在Aspergillus pachycristatusATCC58397中利用同源重组的方法,使用草铵膦抗性基因bar作为筛选基因,使用构巢曲霉强启动子过表达Aspergillus pachycristatus ATCC58397菌株棘白霉素B生物合成基因簇中的基因ecdJ,得到重组菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌的构建方法,其特征在于,将ecdJ基因起始密码子ATG上游一段DNA序列作为同源重组片段3,将ecdJ基因起始密码子ATG下游一段DNA作为同源重组片段4;以5’-3’顺序,将同源重组片段3、草铵膦抗性基因bar、启动子Ptef1和同源重组片段4通过融合PCR的方式,组装成一条DNA片段,作为转化片段;将这一转化片段转化进入Aspergillus pachycristatus ATCC58397菌株,得到工程菌株Aspergilluspachycristatus JOE;
8.根据权利要求4~7任一项所述的基因工程菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
9.根据权利要求1~8任一项所述的基因工程菌在制备棘白霉素B中的应用。
10.aniJ或ecdJ基因的编码蛋白作为棘白霉素B基因簇的转录激活因子的应用,
...【技术特征摘要】
1.高产棘白霉素b的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌过表达anij基因或过表达ecdj基因,
2.根据权利要求1所述的高产棘白霉素b的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的出发菌为曲霉菌。
3.根据权利要求2所述的高产棘白霉素b的基因工程菌,其特征在于,所述曲霉菌选自aspergillus nidulans atcc58396或aspergillus pachycristatus atcc58397。
4.一种基因工程菌的构建方法,其特征在于,在aspergillus nidulans atcc58396中利用同源重组的方法,使用草铵膦抗性基因bar作为筛选基因,使用构巢曲霉强启动子过表达aspergillus nidulans atcc58396菌株棘白霉素b生物合成基因簇中的基因anij,得到重组菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法,其特征在于,将anij基因起始密码子atg上游一段dna序列作为同源重组片段1,将anij基因起始密码子atg下游一段dna作为同源重组片段2;以5’-3’顺序,将同源重组片段1、草铵膦抗性基因bar、启动子ptef1和同源重组片段2通过融合pcr的方式,组装成一条dna片段,作为转化片段;将这一转化片段转化进入aspergillus nidulans atcc58396,得到工...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵方龙,田园,徐清,张月,庞萌,李瑞,付右秀,
申请(专利权)人:山东第一医科大学山东省医学科学院,
类型:发明
国别省市:
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