【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，涉及一种ctdna检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、近红外电化学发光(nir ecl)已成为一种强大的分析技术，因为它结合了近红外和ecl分析方法的优点，如具有良好的光稳定性，易于控制和零背景信号。尽管人们探索了各种近红外ecl发光团，如半导体量子点(qds)、金属纳米团簇和镧系金属有机骨架，但它们的广泛应用受到重金属、高成本、低效率和生物相容性差等问题的阻碍。因此，开发高效的近红外ecl发光体对于推进生物分析和传感性能仍然至关重要。
2、近来，有机纳米材料，例如有机聚合物和小分子纳米粒子，表现出独特的光学特性，卓越的生物相容性和低毒性等，使它们适用于生物传感和成像。目前，通过调控有机分子结构已经建立了各种放大技术以提高ecl效率(φecl)，如增强吸电子基团、共振能量转移(ret)、双ret、聚集诱导发射(aie)和双分子内电子转移。值得注意的是，在光物理中，大多数有机体系都属于荧光范畴，而基于理论考虑，对荧光有机发射体φecl的增强通常受到自旋统计的约束。在电化学激发下，最低单重态(s1)产生激发态(1r*)的比例约为25％，三重态(t1)产生激发态(3r*)的比例约为75％。然而，只有1r*可以通过荧光通道进行辐射跃迁产生ecl。而占主导地位的激发三重态(3r*)则不能从t1跃迁到基态，因此不能产生ecl。相反，它会产生非辐射跃迁。因此，尽管特定的荧光有机发光体具有较高的光致发光量子产率(φpl)，但其φecl仍然受到其固有荧光特性的限制。
3、热激活延迟荧光(tadf)
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种ctdna检测试剂盒及检测方法，引入tadf技术来优化近红外ecl检测。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种ctdna检测试剂盒，包括：用于靶标扩增的试剂，所述试剂包括第一阶段扩增试剂和第二阶段扩增试剂；所述第一阶段扩增试剂用于对靶标进行第一阶段扩增；所述第二阶段扩增试剂用于对第一阶段扩增的产物进行进一步扩增；所述第一阶段扩增试剂包括h1和exo iii；其中，h1为seq id no.1所示序列；所述第二阶段扩增试剂包括h2、dntp、dna聚合酶、cleaner g和mgcl2；其中，h2为seq id no.2所示序列；信号标记物tpa-dcpp nps，名称为7,1-双(4-(二苯基氨基)苯基)-2,3-双氰基吡嗪并菲纳米粒子；保护探针，所述保护探针为bhq3修饰的seq id no.3所示核酸序列，用于猝灭tpa-dcpp nps的ecl信号；硫代捕获探针，所述硫代捕获探针为巯基修饰的seq id no.4所示核酸序列，用于捕获所述保护探针；所述检测试剂盒用于ctdna的检测或辅助鉴定，所述检测或辅助鉴定以非疾病诊断为目的。
4、本专利技术还提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的ctdna检测方法，包括以下步骤：
5、s1.将h1、exo iii和含有靶标的溶液在37℃下共孵育50-80min，然后加热使exoiii失活，然后自然冷却至室温，得到含有primer的exo iii辅助反应体系；
6、s2.将所述exo iii辅助反应体系和h2加入到反应溶液中孵育1-3h，所述反应溶液中含有dntp、dna聚合酶、cleaner g和mgcl2，加热使dna聚合酶失活后自然冷却至室温，得到per产物；
7、s3.将硫代捕获探针溶液和保护探针溶液混合，37℃下孵育1h，形成双链捕获probe@protector探针；
8、s4.将信号标记物tpa-dcpp nps滴涂在玻碳电极上，得到tpa-dcpp nps/gce；
9、s5.在所述tpa-dcpp nps/gce上修饰au nps，得到au nps/tpa-dcpp nps/gce；
10、s6.将所述双链捕获probe@protector探针修饰在所述au nps/tpa-dcpp nps/gce上，在4℃下孵育过夜，得到probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce；
11、s7.室温下将mch作用于probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce，封闭非特异性活性位点；
12、s8.将得到的per产物与probe@protector/au nps/tpa-dcpp nps/gce孵育80-120min，在37℃下测定ecl信号。
13、进一步的，步骤s1中，h1、exo iii和含有靶标的溶液的体积比为10:5:10，其中，exoⅲ的浓度为1u/μl。
14、进一步的，步骤s2中，所述exo iii辅助反应体系、h2和反应溶液的体积比为5:5:20，所述反应溶液中，dna聚合酶的浓度为0.6u/μl。
15、进一步的，上述ctdna检测方法具体包括以下步骤：
16、步骤1、制备tpa-dcpp小分子，名称为7,1-双(4-(二苯基氨基)苯基)-2,3-双氰基吡嗪并菲，供体-共轭桥-受体-共轭桥-供体(d-π-a-π-d)结构；
17、步骤2、纳米沉淀法合成tpa-dcpp nps；所得产物呈现出球状，具有良好的分散性；tpa-dcpp nps具有d-π-a-π-d的结构，其具有优异的共反应剂型ecl。
18、步骤3、tadf增强的近红外电化学发光生物传感器的构建：
19、s1.构建exo iii辅助反应体系：将10μl h1(1μm)、5μl exo iii(1u/μl)和10μl不同浓度的靶标在37℃下共孵育60min，然后在80℃下加热10分钟使exo iii失活，然后自然冷却至室温。
20、s2.制备per产物：将5μl的exo iii辅助反应体系和5μl h2(10nm)加入到20μl的反应溶液中(0.6u/μl dna聚合酶，100nm dntp,100nm cleaner g,1×thermopol缓冲液，10mmmgcl2)孵育2h后，在80℃下热处理20min。
21、s3.将硫代捕获探针capture probe(1μm)和保护探针protector(1.5μm)在37℃下孵育1h，形成双链捕获探针(probe@本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ctDNA检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.一种不以疾病诊断和治疗为目的的ctDNA检测方法，采用权利要求1所述的ctDNA检测试剂盒进行检测，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的ctDNA检测方法，其特征在于，步骤S1中，H1、Exo III和含有靶标的溶液的体积比为10:5:10，其中，ExoⅢ的浓度为1U/μL。
4.根据权利要求2所述的ctDNA检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述Exo III辅助反应体系、H2和反应溶液的体积比为5:5:20，所述反应溶液中，DNA聚合酶的浓度为0.6U/μL。
【技术特征摘要】
1.一种ctdna检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.一种不以疾病诊断和治疗为目的的ctdna检测方法，采用权利要求1所述的ctdna检测试剂盒进行检测，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的ctdna检测方法，其特征在于，步骤s1中，h1、exo ...
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