【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑领域，具体涉及靶向敲除cd70基因的sgrna组合物及其应用。
技术介绍
1、crispr-cas9是继zfn、talens等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，是当今最主流的基因编辑系统。crisrp-cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。该技术就是通过人工设计的sgrna（guide rna）来识别目的基因组序列，并引导 cas9 蛋白酶进行有效切割 dna 双链，形成双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（nhej）对断裂的dna进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。
2、肾癌，又称肾细胞癌，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，占成人恶性肿瘤的2%～3%、小儿恶性肿瘤的20%左右。肾癌的治疗方法主要是手术切除、靶向治疗药物和免疫疗法。目前cd70被认为是肾癌的新型特异性肿瘤标志物。因此，cd70是肿瘤靶向和免疫治疗的良好靶点。目前，已经有多种靶向cd70的药物在研，包括car-t细胞、单抗药物和adc等。
3、cd70是一种ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的t细胞、b细胞及成熟的树突状细胞。cd70受体为cd27，cd70与cd27作用可以促进t细胞和b细胞的活化、增殖及分化，并调节免疫应答。在正常情况下，高表达于
4、根据查询clinicaltrials，与cd70 car-t相关的有多家在研，比如浙江大学和yake biotechnology、shenzhen geno-immune medical institute、crisprtherapeutics、allogene therapeutics。适应症主要为肾细胞癌，其他也包括急性髓系白血病非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及其他b细胞恶性肿瘤等血液肿瘤。目前尚无靶向cd70的相关产品上市，但部分研究已经进入临床阶段，主要的适应症为血液肿瘤和肾癌。据中国国家药品监督管理局药品审评中心（cde）和美国食品药品监督管理局（fda）显示，目前全球有三款cd70 car-t细胞治疗产品获得ind批准进入注册临床以探索实体瘤的治疗。
5、靶向cd70的car-t细胞治疗产品在进行体内外功能验证时，需要评估不同来源的cd70 car-t细胞对肾癌细胞系和小鼠肿瘤模型的抗肿瘤活性。常用的肾癌细胞系有achn细胞，源自一名22岁患有肾细胞腺癌的白人男性的胸腔积液，是剪切过的人腺病毒5（ad5）转染的人胚肾细胞形成的永生化细胞。在体内研究中，常使用achn细胞构建小鼠肾癌模型，用于探索肾癌治疗方法的研究。cd70在achn中高表达，可被cd70 car-t细胞靶向识别，是体外功能验证时理想的肾癌细胞系。在评估cd70 car-t细胞对achn细胞的特异性抗肿瘤活性时，我们需要从正反面来进行验证，既要证明cd70 car-t细胞对achn细胞的杀伤作用，同时要证明当cd70在achn细胞中不再表达时，cd70 car-t细胞对achn细胞的杀伤作用将不复存在。因此要建立cd70基因敲除的achn细胞系。现有技术公开了一些靶向敲除cd70的sgrna，而目前未见如本申请能高效敲除achn细胞cd70基因的sgrna组合物产品。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种靶向敲除cd70基因的sgrna组合物及其应用。
2、第一方面，本专利技术提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的sgrna组合物，所述sgrna组合物包含靶向cd70的靶向序列分别为seq id no:1-3的三种sgrna。
3、在一个或多个实施方案中，所述sgrna组合物包含seq id no:4-6所示的三种sgrna。
4、在一个或多个实施方案中，所述sgrna组合物中seq id no:4-6所示的三种sgrna的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；在一些实施方案中，摩尔百分比为50%:50%:50%。
5、在一个或多个实施方案中，所述sgrna是经修饰的。优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种。优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。
6、第二方面，本专利技术提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的组合物，包含：
7、(i)本文任一实施方案所述的sgrna组合物中的三种sgrna；或，含有编码本文任一实施方案所述的sgrna组合物中的三种sgrna的核酸；和
8、(ii)含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域（guide nucleotide sequence-programmable dna binding protein domain）的蛋白；或，含有编码所述含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白的核酸。
9、在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于cas核酸酶。优选地，所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或几种。更优选的，所述cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的cas9。
10、第三方面，本专利技术提供一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的方法，所述方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白和本文任一实施方案所述的sgrna组合物导入细胞、对cd70基因进行编辑，所述sgrna组合物引导所述含有引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的蛋白对cd70基因进行切割并形成断裂位点。
11、在一个或多个实施方案中，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物包含靶向CD70的靶向序列分别为SEQ ID NO:1-3的三种sgRNA；优选地，所述sgRNA组合物包含SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA。
2.根据权利要求1所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物中SEQ ID NO:4-6所示的三种sgRNA的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；优选地，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；更优选地，摩尔百分比为50%:50%:50%。
3.根据权利要求1所述的sgRNA组合物，其特征在于，所述sgRNA组合物中的任一种或几种sgRNA是经修饰的；优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种；优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。
4
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶；优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
6.一种对细胞内CD70基因进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物导入细胞、对CD70基因进行编辑，所述权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物引导所述含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白对CD70基因进行切割并形成断裂位点。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域来源于Cas核酸酶；优选地，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或几种；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将含有引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的蛋白和sgRNA组合物导入细胞的方式选自电穿孔、载体转化、转染、热休克、转导、基因枪或显微注射；优选地，采用电穿孔的方式。
9.权利要求6-8任一所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。
10.权利要求1-3任一所述的sgRNA组合物、权利要求4-5任一所述的组合物在制备对细胞内CD70进行基因编辑的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的sgrna组合物，其特征在于，所述sgrna组合物包含靶向cd70的靶向序列分别为seq id no:1-3的三种sgrna；优选地，所述sgrna组合物包含seq id no:4-6所示的三种sgrna。
2.根据权利要求1所述的sgrna组合物，其特征在于，所述sgrna组合物中seq id no:4-6所示的三种sgrna的摩尔百分比为(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%):(0.000001%-99.999999%)；优选地，摩尔百分比为(40%-60%):(40%-60%):(40%-60%)；更优选地，摩尔百分比为50%:50%:50%。
3.根据权利要求1所述的sgrna组合物，其特征在于，所述sgrna组合物中的任一种或几种sgrna是经修饰的；优选地，所述修饰为核苷酸修饰、核苷酸间修饰、5’端修饰和3’端修饰、糖修饰、糖-核苷酸间连接键修饰中的一种或几种；优选地，所述修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或几种。
4.一种对细胞内cd70基因进行基因编辑的组合物，其特征在于，包含：
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域来源于cas核酸酶；优选地，所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、...
【专利技术属性】
技术研发人员：江鹏斐，王海鹰，熊青卉，袁秀杰，申秋霜，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。