紫花苜蓿高效组织培养再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种紫花苜蓿高效组织培养再生方法，其依次包括有如下步骤：（１）无菌苗的培养；（２）将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；（３）将愈伤组织转入继代培养基１中进行培养；（４）将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基２中进行继代培养（５）挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；（６）待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养。本发明专利技术的优点在于：本发明专利技术通过添加合适剂量的ＴＤＺ和连续继代实现了紫花苜蓿组织培养中植株的高效再生，应用本发明专利技术方法可以提高紫花苜蓿愈伤组织分化率，比现有技术的分化率平均高出１２．３％。该方法操作简单、植株再生成功率高。本发明专利技术为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种紫花苜蓿高效组织培养再生方法，尤其是涉及一种通过添加TDZ 和连续继代实现紫花苜蓿植株高效再生的培养方法，属于农业生物

技术介绍
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科植物，是世界上重要的栽培牧草， 在我国已有两千多年的栽培历史，其营养价值被列在各种牧草的首位，有“牧草之王”的美 誉，在畜牧业生产中占有重要的地位。随着生物技术的发展，利用基因工程培育和改良植物品种成为便捷和实用的手 段。转基因技术通过引入少量有用基因取代了传统育种中大量基因的介入，减少了无用基 因对性状改良的不良影响，从而可以快速实现育种目标。因此，通过转基因手段将优良基因 转移到栽培品种中，可以加速培育新品种。而转基因的前提就是要建立高效组培再生体系。 苜蓿组织培养最早见于Saunders等的报道，通过器官形成和体胚愈伤组织发育2条途径， 最终分化成完整的植株，这标志着苜蓿组织培养研究的开始。尽管国内外对苜蓿离体再生 体系的研究已经比较深入，但是再生频率低、受基因型影响大、再生周期长等问题目前仍有 待于进一步研究解决。利用现有技术进行紫花苜蓿组织培养，其愈伤组织易褐化、再生率低，针对其不 足，
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过添加TDZ和连续继代实现紫花苜蓿高效组织培 养再生的方法。本专利技术的目的由如下技术方案实施，其依次 包括有如下步骤(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中 培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(5)挑选生长状态好的愈伤组织转 入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养；在所 述步骤(3)和步骤(5)之间增加步骤(4)，其中步骤(4)是将步骤(3)经愈伤组织转入继 代培养基1中进行培养后，即将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中 进行继代培养5-8天；其中所述愈伤组织继代培养基2 :MS+0. 01-0. 5mg/LTDZ+20g/L蔗糖 +7. 5g/L 琼脂，PH 值5. 8-6.0。术语解释TDZ为新型植物生长调节剂，TDZ (N-苯基-N' -1,2, 3~噻二唑_5_脲)能够诱导 外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有植物细胞生长素和植物 细胞分裂素的双重功效作用的特殊功能，在组织培养中TDZ通过单独或与其它生长调节物 质共同对植物细胞起作用。本专利技术的优点在于本专利技术通过添加合适剂量的TDZ和连续继代实现了紫花苜蓿组织培养中植株的高效再生，应用本专利技术方法可以提高紫花苜蓿愈伤组织分化率，比现有 技术的分化率平均高出12.3%。该方法操作简单、植株再生成功率高。本专利技术为进一步利 用基因工程对其进行遗传改良奠定了基础。附图说明图1为的工艺流程图。 具体实施例方式实施例1 ，其依次包括有如下步骤(1)无菌苗的培养；选择饱满、种皮完整无破损的优良紫花苜蓿种子，自来水冲 洗种子30miη，70 %的酒精消毒Imin，无菌水漂洗30S，然后转入20 %的次氯酸钠中消 毒20min，再用无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干种子表面的液体后接种到用于无菌苗培 养的培养基中，培养至长出无菌苗。培养条件为温度25°C，光照时间16h/d，光照强度 1000-2000Lux ；无菌苗培养基为大量元素减半的MS (配方见附表1)(简称1/2MS)培养基 +20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 琼脂。(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养将无菌苗的叶片从中 脉剪开，接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养20-30d。培养条件为温度25°C，光照时间 16h/d，光照强度1000-2000Lux ；诱导培养基为SH(配方见附表2)+4. Omg/L 2,4-D+O. 5mg/ L6-BA+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 琼脂。(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；愈伤组织产生后转移到继代 培养基1中进行继代培养20-30d。培养条件为温度25°C，光照时间16h/d，光照强度 1000-2000Lux ；继代培养基 1 为MS0 (配方见附表 3)+0. 5mg/LNAA+0. 5mg/L 6-BA+l. Omg/ LAgN03+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 琼脂。(4)将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养 5-8天；培养条件为温度25°C，光照时间16h/d，光照强度1000-2000LUX ；其中愈伤组织继 代培养基 2 :MS+0. 01mg/LTDZ+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 琼脂，PH 值5. 8-6. O ；(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养将继代培养II 后的愈伤组织转接到分化培养基上培养，直至分化出苗，每15d继代一次。培养条件为温 度25°C，光照时间16h/d，光照强度1000-2000LUX ；分化培养基为MS+20g/L蔗糖+7. 5g/L 琼脂。(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养待小苗长至3_5cm时转入生 根培养基中培养。培养条件为温度25°C，光照时间16h/d，光照强度1000-2000LUX ；生根 培养基为l/2MS+20g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂。其中附表1MS基本培养基成分组分成分含量(mg/L)大量元素硝酸钾1900硝酸铵1650七水合硫酸镁370二水合氯化钙440磷酸二氢钾170微量元素四水合硫酸锰22.3七水合硫酸锌8.6硼酸6.2碘化钾0.83二水合钼酸钠0.25五水合硫酸铜0.025六水合氯化钴0.025有机元素肌醇100甘氨酸2.0盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素0.1烟酸0.5铁盐乙二胺四乙酸二钠37.3七水合硫酸亚铁27.8附表2SH基本培养基成分权利要求，其依次包括有如下步骤(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养；其特征在于在所述步骤(3)和步骤(5)之间增加步骤(4)，其中步骤(4)是将步骤(3)经愈伤组织转入继代培养基1中进行培养后，即将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养5 8天；其中所述愈伤组织继代培养基2MS+0.01 0.5mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，PH值5.8 6.0。全文摘要本专利技术公开了一种紫花苜蓿高效组织培养再生方法，其依次包括有如下步骤(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(4)将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养。本专利技术的优点在于本专利技术通过添加合适剂量的TDZ和连续继代实现了紫花苜蓿组织培养中植株的高效再生，应用本专利技术方法可以提高紫花苜蓿愈伤组织分化率，比现有技术的分化率平均高出12.3％。该方法操作简单、植株再生成功率高。本专利技术为进一步利用基因工程对其进本文档来自技高网...

【技术保护点】
紫花苜蓿高效组织培养再生的方法，其依次包括有如下步骤：（１）无菌苗的培养；（２）将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；（３）将愈伤组织转入继代培养基１中进行培养；（５）挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；（６）待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养；其特征在于：在所述步骤（３）和步骤（５）之间增加步骤（４），其中步骤（４）是将步骤（３）经愈伤组织转入继代培养基１中进行培养后，即将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基２中进行继代培养５－８天；其中所述愈伤组织继代培养基２：ＭＳ＋０．０１－０．５ｍｇ／ＬＴＤＺ＋２０ｇ／Ｌ蔗糖＋７．５ｇ／Ｌ琼脂，ＰＨ值：５．８－６．０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐春波，王勇，赵来喜，赵海霞，李兴酉，
申请(专利权)人：中国农业科学院草原研究所，
类型：发明
国别省市：15[中国|内蒙]