大豆非组织培养植株再生方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种大豆非组织培养植株再生方法及其应用。本发明专利技术提供的培养再生植株的方法，包括如下步骤：将植物苗的顶芽和根去除，再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴，将１个植物苗一分为二，分别作为外植体，每个外植体在子叶节处均具有１片子叶和１个腋芽；将外植体进行培养，得到植物再生植株；所述植物苗具有如下结构：在子叶节处具有２片子叶及２个腋芽，子叶节之上部分为顶芽和连接子叶节和顶芽的上胚轴，子叶节之下部分为根和连接子叶节和根下胚轴。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术的方法制备再生植株制作简单、成本低、工作效率高，而且绿色环保。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大豆非组织培养植株再生方法及其应用。
技术介绍
在大豆抗病、虫育种时，需要对收集的品种资源、杂交后代、转基因后代进行病、虫 接种鉴定，切取植株某部分组织或器官进行生理、生化分析，同时又要求被检测的植株能够 正常的繁衍后代。这类材料的共同特点是个体数量少，每个个体遗传背景均不相同，而且在 现实中难以重复获得。由于病、虫接种以及切取植株部分组织或器官对植株造成的多为不 可恢复的破坏性损伤，被检测的植株无法繁衍后代。通常对这类材料的鉴定或生理生化指 标检测需要等到它们的后代遗传稳定后才能进行，但这往往需要3-5代的繁殖时间，而且 必保留每个后代的衍生株系，如果按每个植株每代结籽10粒来计算的话，那么经过3代以 后，最初的1粒种子会有1000个后代植株，如果在此时进行病、虫接种鉴定或生理生化分 析，无疑大大增加实验规模，同时耗费巨大的人力、物力，而大规模接种病、虫也是非常不现 实的行为。植物的另一种繁殖途径是通过无性繁殖即组织培养的方法，但组织培养需要严 格的无菌条件和培养条件，不同品种的再生都具有很强的基因型依赖性，而且培养周期长 于植物正常的生长周期。因此，开发一种能在早世代进行病、虫害接种鉴定且不影响植株正 常繁殖的方法已成为提高育种效率的迫切需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆非组织培养植株再生方法及其应用。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将植物苗的顶芽去除，再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴，将1个植物苗一分为二， 分别作为外植体，每个外植体在子叶节处均具有1片子叶和1个腋芽；将外植体进行培养， 得到植物再生植株；所述植物苗具有如下结构在子叶节处具有2片子叶及2个腋芽，子叶节之上部分 为顶芽和上胚轴，子叶节之下部分为根和下胚轴。所述上胚轴连接所述顶芽和所述子叶节，所述下胚轴连接所述根和所述子叶节。所述将顶芽去除的位置是从所述子叶节处除去；在所述培养植物再生植株的方法中，所述将植物苗的顶芽去除和所述再沿子叶接 缝处平分纵切下胚轴的步骤间还包括如下步骤将所述植物苗的根去除的步骤，所述植物 苗的根去除位置是自所述子叶节处下数2cm-3cm处；所述将根去除的位置具体为自子叶节 处下数2cm、2. 5cm或3cm处。所述将外植体进行培养的方法包括将外植体的子叶节以下部分均埋入基质中，再 进行培养，得到再生植株幼苗；所述基质为无菌蛭石；所述培养的条件包括温度为24V -26°C，光照条件为每天14小时-18小时光照/10小时-6小时黑暗，光照强度为100 μ mol/m2/s-140 μ m0l/m2/S，相对湿度为60% -90%, 所述温度具体为24°C、25°C或26°C，所述光照条件具体为每天14小时光照/10小时黑暗、 16小时光照/8小时黑暗或18小时光照/6小时黑暗，所述光照强度具体为100 μ mol/m2/ sU20ymol/m2/s或140 μ mol/m2/s，所述相对湿度具体为60%、80%或90%。所述培养的 时间为20天-30天，所述培养的时间具体为20天、25天或30天。所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物优选为豆科植物，尤其优选为大豆。所述的方法在植物的遗传育种鉴定中的应用也是本专利技术保护的范围。所述应用中，所述遗传育种鉴定为抗病性鉴定。所述病为大豆花叶病毒病或者大豆锈病。所述大豆花叶病毒病为的病原菌为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y 病毒属(potyvirus)、大豆花叶病毒种soybean mosaic virus。所述大豆锈病的病原菌 为担子菌纲(basidomycetes)、锈菌目(Urediales)、栅锈科(Malampsoraceae)、层锈属 (Phakopsora) >^viiMlifft (Phakopsora pachyrhizi Sydow)。本专利技术的实验证明，本专利技术的方法具有如下优点1)条件简单培养过程中无需无菌条件，一般实验室均可进行；2)培养过程不需任何培养基反应过程中仅需提供足够的水和光源，大豆子叶具 有足够的营养满足腋芽发育成一个新的植株，省去了研制培养基配方的过程；3)外植体制备工艺简单，便于掌握外植体制备时对幼苗要求不是特别严格， 7-10天的幼苗均可采用，外植体制备时，仅需要去掉顶芽，纵切子叶节即可，一个普通工人 稍加培训即可掌握；4)周期短非组织培养再生从种子萌发到再生植株形成仅需要1个月时间，而大 豆组织培养再生从种子萌发到获得再生植株需3-4个月的时间；5)遗传背景不发生任何改变由于培养过程没有使用任何激素，因此再生植株没 有发生任何个体变异。而大豆组织培养中由于需要添加激素诱导再生苗，组培苗会有不同 程度的个体变异，影响后期鉴定结果；6)没有基因型依赖性大豆所有品种均在子叶节处含有两个腋芽，当顶芽受到破 坏时，腋芽均能发育成完整植株。而组织培养的再生植株则受基因型的限制，并非每个基因 型都能诱导出再生植株；7)成苗率高大豆非组织培养再生全过程没有使用任何植物激素，生根正常，由 于未经无菌培养，无需炼苗过程，成苗率均在90%以上。而组织培养获得的再生苗由于经过 细胞分裂素处理，容易发生生根困难的现象，从无菌苗到室外培养需要炼苗阶段，成苗率会 有所降低；8)降低成本大豆非组织培养再生全过程不需要特殊的设备和培养基，省去了组 织培养过程中种子消毒、无菌操作、培养基配制、激素调整等工序，植株再生时间由组织培 养再生所需的3-4个月缩短到1个月，不仅节省了时间，也节省了大量设备投资、运行费用 以及人工费用。适于大规模实验；9)提高工作效率大豆非组织培养再生成苗率在90%以上，特别适用于杂交早世 代、转基因早世代、收集的种质资源等个体数量少、个体重复获得性差、遗传背景高度不稳 定的材料进行抗病、虫鉴定和生理生化检测，及时获得遗传数据，进行遗传分析，同时通过早世代鉴定，及时淘汰抗性、生理生化不符合育种目标的后代，能有效减小后代规模，提高 育种效率；10)绿色环保大豆非组织培养再生全过程仅需要光照和清水，无需任何化学物 质，有很强的环保概念，可以解决常规繁种和组织培养方法难以解决的问题。综上所述，本专利技术方法得到的再生植株能够正常开花结实，并可进行抗病、虫鉴 定，生理生化指标鉴定。本专利技术工艺简单，植株成活率高，可适于种苗扩繁、特别适用于收集 的种质资源、杂交低世代后代材料、转基因后代材料等个体数量少的群体进行抗性鉴定以 及其他破坏性生理生化指标测定。它既可满足早世代育种材料进行各种破坏性鉴定的需 要，也保证了种子繁殖的需要，主要用于早世代育种材料抗病、虫接种鉴定、具有破坏性的 生理生化指标鉴定以及种质资源中优异单株的鉴定和分离。附图说明图1为大豆非组织培养植株再生过程 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、非组织培养再生大豆植株方法一1)种子萌发选取饱满无病斑的大豆种子(Glycine max L.)(购自武汉中油天隆种业科技有 限公司)，清水浸泡10小时，种子和用水量为Ig 10ml，待种子彻底吸胀后，将种子铺在 15 X 40CM的纸带上，纸带上铺一层吸水纸，种子沿纸带的长边铺成1行，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得植物再生植株的方法，包括如下步骤：将植物苗的顶芽去除，再沿子叶接缝处平分纵切下胚轴，将１个植物苗一分为二，分别作为外植体，每个外植体在子叶节处均具有１片子叶和１个腋芽；将外植体进行培养，得到植物再生植株；所述植物苗为具有如下结构的苗：在子叶节处具有２片子叶及２个腋芽，子叶节之上部分为顶芽和上胚轴，子叶节之下部分为根和下胚轴。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：单志慧，沙爱华，陈海峰，陈李淼，郝青南，孙佃臣，田星星，周新安，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]